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癌蛋白质TAL1与LSD1的相互作用在造血过程和白血病生成过程中的调控机制

作　者: 李莹
导　师: 赵志壮；付学奇
学　校: 吉林大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: TAL1/SCL LSD1 组蛋白H3K4甲基化作用丝氨酸磷酸化作用表观遗传调控作用造血功能
分类号: R733.7
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

TAL1/SCL是碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族中的一员,具有造血功能特异性。在造血过程中,TAL1/SCL决定着造血干细胞(HSCs)的生成以及维持其自我更新修复的能力,并在红细胞的末端分化过程中起着重要的调控作用。另外,TAL1/SCL在T细胞发育过程中的异常表达会导致T细胞急性淋巴细胞白血病的发生。TAL1的活性主要受与其互作的共激活因子或共抑制因子的调控,这种调控作用对于造血细胞的分化进程具有决定性作用,然而,对于如何调控TAL1与其共抑制因子或共激活因子间的相互作用还不清楚。TAL1/SCL转录因子包含一些苏氨酸(Thr)残基和丝氨酸(Ser)残基,它们可以被蛋白质激酶B(Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白质激酶A(PKA)进行磷酸化修饰。其中,丝氨酸172位点(S172)可以特异性地被PKA磷酸化,这个磷酸化作用可以影响TAL1对其某个靶向依赖性DNA的识别,进而在细胞分化的过程中选择性地发挥转录调控作用。TAL1的这种转录活性的调控机理表明,类似的修饰作用也可能决定TAL1与其转录共抑制因子或共激活因子相互作用的能力。为了揭示TAL1与其共调节因子复合物的作用机制以及这个机制的功能紊乱在T细胞白血病产生过程中的作用,我们对TAL1与其共抑制因子LSD1相互作用的分子机制进行了详细的研究。本研究表明,PKA介导的磷酸化作用可以动态地调控TAL1与H3K4去甲基化酶LSD1复合物间的相互作用。TAL1Ser172位点的磷酸化作用能够特异性地破坏TAL1与LSD1的结合,导致造血细胞中的靶基因启动子甲基化水平上升,从而使其抑制靶基因转录激活。在T-ALL细胞中,下调TAL1或LSD1的表达水平会导致TAL1靶基因的抑制作用失活,并伴随着LSD1在靶基因增强子或启动子区域的结合能力下降,而同一位点上的H3K4甲基化作用上升。同样,在PKA激活剂forskolin处理的T-ALL细胞中,由于LSD1与TAL1的相互作用下降,导致靶基因抑制作用失活,而PKA抑制剂H89却使其仍处于抑制状态。另外,与TAL1在转录作用中的双重调节功能一致,在红细胞分化的过程中,TAL1与组蛋白去甲基化酶LSD1的相互作用下降的同时,与组蛋白甲基化转移酶hSET1的结合上升,同时伴随着靶基因上H3K4甲基化修饰作用的增加。我们的研究发现,TAL1与LSD1互作结构域中的Serine172位点的磷酸化作用能够调节TAL1与LSD1间的相互作用,并且这一过程可以通过PKA的介导来完成。这个磷酸化作用能够动态地调节TAL1对LSD1复合物的招募,并直接影响靶基因的转录,而这些基因对于造血祖细胞的分化和T细胞的发育都是十分必要的。PKA的激活剂forskolin能够通过降低TAL1与LSD1间的结合刺激其靶基因的表达,而PKA的抑制剂H89则可以通过抑制启动子的H3K4甲基化水平进而抑制靶基因转录。因此,我们的结果表明PKA介导的磷酸化作用动态调控着TAL1与组蛋白去甲基化酶LSD1的相互作用,并通过调节启动子H3K4甲基化作用控制TAL1靶基因的转录。本论文对PKA的磷酸化作用在TAL1介导的表观遗传调控过程中所发挥的功能,及其在造血细胞的分化进程和T细胞发育的过程中起到的关键决定性作用进行了研究,揭示了TAL1与组蛋白去甲基化酶LSD1间的互作机制,为进一步了解TAL1这个转录因子在调控红细胞分化以及T细胞白血病的发生中的作用提供了理论依据。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
英文略缩词表  10-13
第一章前言  13-41
  第一节表观遗传学  13-18
    1.1.1 DNA 甲基化作用  14-15
    1.1.2 组蛋白编码修饰、核小体重组和高级染色质形成  15-16
    1.1.3 RNA 介导的沉默途径  16
    1.1.4 表观遗传学与疾病的关系  16-18
  第二节组蛋白去甲基化酶LSD1  18-23
    1.2.1 LSD1 介导的去甲基化作用  19-20
    1.2.2 LSD1 蛋白质复合物  20-22
    1.2.3 LSD1 对非组蛋白的去甲基化作用  22-23
  第三节红细胞生成过程中的调控机制  23-28
    1.3.1 蛋白质激酶A  24-25
    1.3.2 cAMP/PKA 对红细胞信号通路的调控  25-27
    1.3.3 cAMP/PKA 在红细胞发病机理中的作用  27-28
  第四节 T 细胞的发育过程  28-31
    1.4.1 调控早期T 前体细胞功能和命运的重要调控因子  28-30
    1.4.2 T 细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）  30-31
  第五节 T 细胞急性淋巴白血病因子TAL1/SCL  31-39
    1.5.1 TAL1 在造血细胞发育中的功能  31-34
    1.5.2 TAL1 相关的信号通路  34-35
    1.5.3 TAL1 在T-ALL 中的功能紊乱作用  35-38
    1.5.4 TAL1 复合物在正常造血功能的转录调控中的作用  38
    1.5.5 染色质中TAL1 的转录调控作用  38-39
  第六节研究目的与意义  39-41
第二章材料与方法  41-59
  第一节实验材料  41-49
    2.1.1 试剂  41-42
    2.1.2 引物  42-44
    2.1.3 细胞株与菌种  44-45
    2.1.4 重组质粒  45
    2.1.5 缓冲液  45-48
    2.1.6 试剂盒  48-49
    2.1.7 仪器  49
  第二节实验方法  49-59
    2.2.1 GST pull down assays  49-51
    2.2.2 体外磷酸化试验  51-52
    2.2.3 免疫共沉淀和免疫印迹  52-53
    2.2.4 染色质免疫沉淀  53-56
    2.2.5 细胞分化实验和细胞增殖实验  56
    2.2.6 逆转录病毒感染细胞  56-57
    2.2.7 LSD1 siRNA knockdown  57-58
    2.2.8 软琼脂集落试验  58-59
第三章实验结果  59-80
  3.1 TAL1 Serine172 位点的磷酸化作用在红细胞分化进程中的作用  59-67
    3.1.1 TAL1 Serine172 位点的磷酸化作用干扰了其与LSD1 的相互作用  59-62
    3.1.2 Serine172 位点在调控p4.2 基因转录抑制过程中的重要作用  62-65
    3.1.3 TAL1 靶基因p4.2 的转录激活伴随着LSD1 作用的下降  65-67
  3.2 TAL15erine172 位点的磷酸化作用在T-ALL 细胞中的作用  67-80
    3.2.1 TAL1 招募LSD1 对T 细胞发育所需基因的抑制作用  67-71
    3.2.2 在T-ALL 细胞中，LSD1 是TAL1 靶基因转录抑制所必需的  71-73
    3.2.3 TAL15erine172 位点在TAL1 抑制转录活性中的作用  73-76
    3.2.4 PKA 介导的磷酸化作用对TAL1 抑制活性的调控  76-80
第四章结论与讨论  80-83
参考文献  83-92
攻博期间发表的学术论文  92-94
致谢  94

癌蛋白质TAL1与LSD1的相互作用在造血过程和白血病生成过程中的调控机制

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