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牙齿是特殊的矿化器官,由釉质、牙本质、牙骨质和牙髓组成,其中牙本质构成牙齿的主体。牙本质起源于牙源性上皮和外胚间充质的相互作用,进而诱导成牙本质细胞分化成熟,合成和分泌细胞外有机基质,然后羟基磷灰石晶体沉积,矿化开始形成。在矿化过程中,细胞外基质起着非常重要的作用。其中最关键的是牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)和牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein,DPP),它们来源于同一个编码基因——牙本质涎磷蛋白基因(dentin sialophosphoprotein,DSPP)。长期以来,国内外学者对DSPP基因及其编码蛋白做了大量研究,DSPP基因的表达调控一直是研究的焦点。近年来,研究人员发现那些过去不被重视的非编码RNA在生物体的生命活动中起着不可忽视的作用,对编码RNA的转录、翻译有着巨大的调控作用,掀起了非编码RNA研究的热潮。1nicroRNA(miRNA)即是非编码RNA大家族中的一贝。miRNAs是一类长约22个核苷酸(nt)的内源性的、非编码的单链RNA分子,它们广泛存在于从植物、线虫到人类的细胞中。迄今为止,在动植物中已经发现了数千个miRNA基因,目前认为在不同物种中,编码miRNA的基因约占蛋白编码基因的1%左右,它们通过与所靶向基因的mRNA的3’UTR区互补结合,实现对靶向mRNA的降解或者翻译抑制,进而作为一类重要的调控分子,参与对生物体的生长、发育、衰老和死亡的调控。在正常生理状态下,生物体内的miRNAs表达呈严格的组织及发育阶段特异性,不同的组织和细胞在发育的不同阶段,miRNA的表达水平有显著差异。在口腔颌面部发育研究领域,Jevnaker等最先运用芯片研究miRNAs在大鼠牙胚和涎腺中的表达,发现在牙胚发育的不同阶段miRNAs表达是动态调控的,一些miRNAs的表达呈组织特异性,并通过生物信息学预测这些miRNAs是牙齿发育,乃至口腔颌面部组织器官发育调控的必需因子。基于前人的研究成果,为了更全面、深入的探讨miRNA对DSPP表达的调控作用,及其对成牙本质细胞分化的作用,本课题利用生物信息学软件对可能靶向DSPP基因的miRNAs进行预测,并结合双荧光素酶报告基因系统和实时定量PCR的方法筛选和验证能够靶向调控DSPP基因的miRNAs,然后选取其中一个miRNA——mir586做进一步的研究。同样用生物信息学方法预测mir586与DSPP的结合位点,并通过双荧光素酶报告基因系统进行验证。最后,构建过表达mir586和mir586表达抑制的慢病毒表达载体,转染入牙髓细胞,观察在牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中,mir586对细胞功能的影响。本论文主要包括以下三章内容：第一章：靶向DSPP基因的microRNAs的筛选和验证首先利用Targetscan、mirBase、microRNA.org和mirGen-miRanda生物学软件和数据库对可能靶向DSPP基因的miRNAs进行预测,分别得到了17种、15种、10种、10种miRNAs。然后取有两个以上交集的靶位点的miRNA作为研究对象,得到10种miRNAs。为了进一步筛选和验证在成牙本质细胞中能够靶向调节DSPP基因的miRNAs,本研究采用了双荧光素酶报告基因系统和定量PCR的方法。研究结果显示mir885-5p、mir32、mir586能够抑制荧光素酶的活性,即能够对DSPP基因起作用。在牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中,当DSPP基因的表达增多趋于稳定时,mir885-5p、mir32和mir586在10-14 d的表达量都有所下降。结合文献查阅,以及本章所得结果,我们选择抑制荧光素酶活性最强、表达量变化更显著的has-mir586作为进一步研究对象,探讨其与DSPP基因之间的靶向关系,及其对成牙本质细胞分化的作用。第二章：mir586靶向调节DSPP基因的结合位点分析首先利用Targetscan和MicroRNA.org软件预测mir586靶向调节DSPP基因的可能结合位点,两者显示了同一结合位点(AAUGCAUG)。为了进一步证实mir586通过此位点对DSPP基因起作用,将结合位点序列突变为UUACGUA,分别构建正常的DSPP 3’UTR表达载体和突变型DSPP 3’UTR表达载体,再通过双荧光素酶报告基因系统,检测荧光素酶活性。结果显示mir586能够与DSPP3’UTR结合,从而抑制荧光素酶活性；而mir586不能与突变型DSPP 3’UTR结合,证明mir586通过与DSPP 3’UTR上190-196碱基序列(AAUGCAUG)结合起作用。同时,进一步证实mir586与DSPP基因以这种“短种子”序列结合,可能起到抑制DSPP mRNA翻译的作用。第三章：mir586的功能研究本章主要包括两方面的内容：1.获取mir586过表达和表达抑制的慢病毒首先提取正常人全血中的基因组DNA。分别设计mir586过表达序列和表达抑制序列(anti-mir586):从NCBI中查找到has-mir-586的初始序列,选取包含has-mir-586成熟序列及其两端各约200个碱基的序列作为mir586过表达序列；取mir586互补序列进行3次串联,并根据文献设计anti-mir586序列。然后,以提取的正常基因组DNA为模板,PCR扩增mir586基因片段；以anti-mir586聚合引物序列为模板,使之形成双链anti-mir586基因片段。两个基因片段分别与慢病毒表达载体pLVX-shRNA1相连后,转化到感受态DH5α菌中,挑取阳性克隆,提取质粒并进行鉴定。采用Lenti-XTM HTX Packaging System,将构建好的两个慢病毒过表达载体和包装载体Lenti-XTM HTX Packaging Mix,及转染试剂Xfect transfection,转染293T细胞,收集病毒上清,过滤,浓缩,分装,测定病毒滴度约为5×106IFU/ml。最后,慢病毒感染人牙髓细胞,选择合适浓度的G418筛选稳定转染慢病毒的细胞,扩大培养。应用实时荧光定量PCR的方法分别测定mir586过表达、anti-mir586和阴性对照组感染牙髓细胞后的mir586表达情况,结果显示mir586过表达组mir586的表达量比阴性对照组增加了约6倍,而anti-mir586组的表达量减少了约4倍,mir586的表达非常微弱。2.研究在矿化液诱导牙髓细胞向成牙本质样细胞分化过程中,mir586对细胞增殖和分化的影响选取矿化液诱导的0、3、7、14和21 d作为测定各项指标的时间点。采用MTT法评估细胞的增殖情况,发现正常牙髓细胞在矿化诱导分化开始后,随着细胞数目的增多,细胞生长加快,第7 d,细胞逐渐分化、增殖,呈复层生长,矿化结节增多,14 d后细胞密度过高,出现细胞死亡,生长变缓；anti-mir586组细胞在初期时生长较缓慢,第3 d后生长速度较对照组明显加快,到第10 d,生长速度即开始减慢；mir586过表达组细胞数目不断增多,但细胞增长速度较对照组有所减慢。总的来说,在分化过程中,mir586对细胞增殖的影响不大,mir586表达抑制时,可以在一定程度上促进细胞的生长。通过检测碱性磷酸酶活性评估牙髓细胞的分化情况：正常牙髓细胞矿化诱导下,碱性磷酸酶活性随着分化的进行逐渐增强。mir586过表达组细胞的ALP活性变化不大,后期有上升趋势。而anti-mir586组细胞的ALP活性从第7 d开始显著上升,在矿化诱导14 d达到顶峰。DMP1和DSPP两个基因编码的蛋白是牙齿发育过程中非常重要的非胶原基质蛋白,被认为是成牙本质细胞的特异性因子。牙髓细胞在矿化液诱导下,可形成成牙本质样细胞,DMP1的表达早于DSPP基因,在诱导分化的第7 d即有大量DMP1表达,14 d达到顶峰,随着分化的进行,DSPP的表达在诱导分化7d后逐渐增多。当mir586过表达时,DSPP的表达速度减慢,表达量减少；DMP1的表达也有所降低。而当mir586受到抑制时,从诱导第7 d开始,DSPP的表达量明显多于对照组；DMP1的表达水平则与对照组没有明显差异。用Western blotting检测DSP蛋白的表达情况时发现：对照组牙髓细胞在矿化诱导第10 d可以看到清晰的DSP蛋白条带,而anti-mir586组在诱导第7 d即可以看到蛋白条带；与对照组相比较,mir586过表达组在诱导第10 d时,蛋白条带明显减弱,表明DSP蛋白被降解,致使表达量减少。总的来说,mir586表达抑制时,能够促进牙髓细胞向成牙本质样细胞的分化；当mir586过表达时,牙本质特异性基因DSPP、DMP1表达减少,DSP的表达延迟,且表达量明显减少,大大减缓了牙髓细胞分化的进程。综上所述,本研究通过生物信息学方法预测到多个能作用于牙本质涎磷蛋白基因的miRNAs,通过双荧光素酶报告基因系统和实时荧光定量PCR的方法,重点研究了mir586靶向调控牙本质涎磷蛋白基因的结合位点,并通过构建mir586过表达和表达抑制慢病毒,稳定转染人牙髓细胞,检测矿化液诱导牙髓细胞分化过程中,mir586对细胞增殖和分化的影响。初步研究了miRNAs在成牙本质细胞分化过程中的功能,以及miRNAs对牙本质特异性因子——牙本质涎磷蛋白及其编码基因的调控作用,有利于扩大研究多种miRNAs在牙本质形成中的机制作用,发现新的调控因子和调节途径。
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