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单功能铂类配合物及锌离子探针与蛋白质的作用机理研究

作　者: 王彦卿
导　师: 郭子建
学　校: 南京大学
专　业: 无机化学
关键词: 单功能铂配合物 蛋白质 非共价结合 荧光光谱 作用位点 荧光探针 乙醇脱氢酶 分子模型 分子识别
分类号: O657.3
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


蛋白质是生命体系中最重要的一类生物大分子,有关药物分子与蛋白质相互作用的研究一直是分子生物学中最重要的领域之一。人血清白蛋白(HSA)是人体血浆中含量最丰富的蛋白质,具有转运药物分子的功能。人血红蛋白(Hb)是人体内执行输氧任务的蛋白质,γ-球蛋白(γ-Gb)是最主要的免疫球蛋白之一,亦能够结合药物分子和相关的抗原。为了降低顺铂的毒副作用和克服其抗药性,许多非经典的具有新型结构的铂类配合物不断的被设计出来。关于具有抗癌活性的新型铂类配合物与蛋白质的相互作用对于评价金属配合物的药理及潜在的毒性有着重要意义,同时在指导新型金属药物设计、金属药物药代动力学研究等也具有指导性意义。本研究在总结了目前研究金属配合物与蛋白质相互作用的方法及原理后,选用本课题组设计合成的新型单功能铂类配合物,8-氨基喹啉铂(8-QA-Pt)、萘酰亚胺铂配合物(PEN-Pt)、4,4’-二胺二苯基甲烷为配体的双核铂类配合物(Pt2-L)及以三齿螯合的多吡啶为配体的三核铂配合物(Pt3-L)作为模型药物,利用荧光、紫外、CD、FT-IR、MALDI-TOF及分子模拟等技术研究了该类铂配合物与HSA.Hb及γ-Gb的相互作用,结果发现,该类配合物与蛋白质的作用方式明显不同于顺铂,8-QA-Pt、PEN-Pt及Pt3-L与HSA、Hb及γ-Gb主要以非共价键结合为主,而Pt2-L与HSA存在着共价键结合,与Hb及γ-Gb主要以非共价键结合为主；通过荧光猝灭方法得到了铂类配合物与蛋白质分子间的结合常数和热力学参数,利用作用位点竞争、蛋白质变性及分子模拟等方法研究表明,8-QA-Pt结合在HSA的Subdomain IB内,其它几种铂配合物主要与Subdomain IIA内的氨基酸发生作用,该类铂配合物在蛋白质分子上主要存在着一类结合位点,另外通过分子对接的方式确定了铂类配合物在Hb及γ-Gb的结合区域和结合模式；并用同步荧光、三维荧光、紫外光谱、CD、FT-IR等技术考察了铂配合物对蛋白质微结构的影响,结果发现该类铂配合物未引起蛋白质结构的明显改变。该研究内容有助于解释不同于顺铂的非经典铂类配合物的药理及药代动力学以及指导设计新型的铂类抗癌药物,通过选择合适的配体形成新型的铂配合物,实现不同于顺铂等经典铂类药物与常见转运蛋白的结合方式,提高有效药物的浓度和发挥药效的新方式。对蛋白质进行选择性的定性、定量的检测在生命科学、医药、和生物化学等方面具有重要意义。利用荧光探针对生物大分子进行定性、定量的选择性检测是许多生物化学家所关心的热点问题,关于利用荧光探针选择性识别乙醇脱氢酶的报道较少。本研究中选用可见光激发的7-硝基苯并呋咱(NBD)类荧光团新型的锌离子探针NBD-TPEA作为识别蛋白质的研究对象,研究其对乙醇脱氢酶(ADH)、碳酸酐酶(CAH)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、溶菌酶(Lys)、胰蛋白酶(Trypsin、γ-球蛋白(γ-Gb)等不同结构和功能的生物大分子的荧光响应性质,从而说明NBD-TPEA探针的生物学性质。此外重点研究了乙醇脱氢酶与NBD-TPEA的作用机理。实验结果发现不同结构和功能的蛋白对NBD-TPEA及NBD-TPEA-Zn的荧光产生不同程度的增敏影响,蛋白质中Trp残基的个数与其影响探针的荧光性质没有直接关系,其中ADH对探针的荧光产生明显的增敏效应,并计算了ADH与探针的结合常数及结合热力学类型,表明ADH与NBD-TPEA及NDB-TPEA-Zn的主要作用力为疏水、静电和氢键作用力；并用分子模拟的方法对其与ADH、CAH、GDH、Trypsin、HSA、γ-Globin、Lys的相互作用进行了研究,发现ADH中Tyr155与NBD环上的硝基形成氢键是ADH荧光增敏NBD-TPEA及NBD-TPEA-Zn可能的主要原因之一。这一结构研究有助于实现该类探针对ADH的荧光分子识别及针对不同蛋白质结构设计合成新型的能够选择性识别蛋白质的荧光探针。

全文目录


中文摘要  8-10
Abstract  10-13
第一章 绪论  13-35
  1.1 蛋白质  13-19
    1.1.1 蛋白质的分类及结构  13-15
    1.1.2 人血清白蛋白  15-16
    1.1.3 血红蛋白  16
    1.1.4 丙种球蛋白  16-17
    1.1.5 金属硫蛋白  17-18
    1.1.6 锌指蛋白  18
    1.1.7 乙醇脱氢酶  18-19
  1.2 铂类抗癌药物  19-21
    1.2.1 顺铂及其类似物抗癌药物  19-20
    1.2.2 单功能的铂类配合物  20
    1.2.3 多核铂类配合物  20-21
  1.3 金属配合物与蛋白质相互作用的研究方法  21-28
    1.3.1 紫外可见吸收光谱法  22-23
    1.3.2 荧光光谱法  23-26
    1.3.3 圆二色谱法  26-27
    1.3.4 傅立叶变换红外光谱法  27
    1.3.5 质谱  27-28
  1.4 金属配合物与蛋白质相互作用的研究实例  28-30
  1.5 本论文研究的主要内容  30-31
  参考文献  31-35
第二章 8-氨基喹啉铂配合物与人血清白蛋白、血红蛋白及γ-球蛋白相互作用的研究  35-56
  2.1 前言  35-36
  2.2 实验部分  36-37
    2.2.1 仪器及主要试剂  36
    2.2.2 实验方法  36-37
  2.3 结果与讨论  37-54
    2.3.1 8-QA-Pt与HSA、Hb及γ-Gb的作用  37-45
    2.3.2 8-QA-Pt对HSA、Hb及γ-Gb的荧光猝灭机理  45-48
    2.3.3 8-QA-Pt与HSA、Hb及γ-Gb结合参数的计算  48-50
    2.3.4 8-QA-Pt在蛋白质上结合位置的推断  50-54
  2.4 结论  54
  参考文献  54-56
第三章 N-(2-吡啶乙基)-1,8-萘酰亚胺铂配合物与人血清白蛋白、血红蛋白及γ-球蛋白相互作用的研究  56-77
  3.1 前言  56-57
  3.2 实验部分  57-58
    3.2.1 仪器及主要试剂  57
    3.2.2 实验方法  57-58
  3.3 结果与讨论  58-75
    3.3.1 PEN-Pt与HSA、Hb及γ-Gb的作用  58-67
    3.3.2 PEN-Pt对HSA、Hb及γ-Gb的荧光猝灭机理  67-70
    3.3.3 PEN-Pt与HSA、Hb及γ-Gb结合力类型的判断  70-72
    3.3.4 PEN-Pt在蛋白质上结合位置的推断  72-75
  3.4 结论  75
  参考文献  75-77
第四章 一种单功能双核铂配合物与人血清白蛋白、血红蛋白及γ-球蛋白相互作用的研究  77-95
  4.1 前言  77-78
  4.2 实验部分  78-79
    4.2.1 仪器及主要试剂  78
    4.2.2 实验方法  78-79
  4.3 结果与讨论  79-93
    4.3.1 Pt_2-L与HSA、Hb及γ-Gb作用的荧光光谱  79-81
    4.3.2 Pt_2-L与HSA、Hb及γ-Gb键合模式的确定  81-83
    4.3.3 Pt_2-L对HSA、Hb及γ-Gb二级结构的影响  83-89
    4.3.4 Pt_2-L与HSA、Hb及γ-Gb的结合距离  89-90
    4.3.5 Pt_2-L在蛋白质上结合位点的推断  90-93
  4.4 结论  93
  参考文献  93-95
第五章 一种单功能三核铂配合物与人血清白蛋白、血红蛋白及γ-球蛋白相互作用的研究  95-114
  5.1 前言  95-96
  5.2 实验部分  96-97
    5.2.1 仪器及主要试剂  96
    5.2.2 实验方法  96-97
  5.3 结果与讨论  97-112
    5.3.1 Pt_3-L与HSA、Hb及γ-Gb的作用  97-104
    5.3.2 Pt_3-L对HSA、Hb及γ-Gb的荧光猝灭机理  104-107
    5.3.3 Pt_3-L与HSA、Hb及γ-Gb键合模式的确定  107-109
    5.3.4 Pt_3-L在蛋白质上结合位置的推断  109-112
  5.4 结论  112
  参考文献  112-114
第六章 一种锌离子探针与乙醇脱氢酶的相互作用  114-137
  6.1 前言  114-116
  6.2 实验部分  116-117
    6.2.1 仪器及主要试剂  116
    6.2.2 实验方法  116-117
  6.3 结果与讨论  117-135
    6.3.1 NBD-TPEA及NBD-TPEA-Zn的紫外光谱  117-118
    6.3.2 NBD-TPEA及NBD-TPEA-Zn的荧光光谱  118-119
    6.3.3 蛋白质对NBD-TPEA的荧光光谱影响  119-122
    6.3.4 蛋白质对NBD-TPEA-Zn的荧光光谱影响  122-124
    6.3.5 ADH与NBD-TPEA与NBD-TPEA-Zn的结合机理  124-128
    6.3.6 NBD-TPEA及NBD-TPEA-Zn对ADH二级结构的影响  128
    6.3.7 NBD-TPEA及NBD-TPEA-Zn在ADH上结合位点的分子模拟  128-130
    6.3.8 ADH对NBD-TPEA及NBD-TPEA-Zn荧光增敏机理的推测  130-135
  6.4 结论  135
  参考文献  135-137
附录  137-138
致谢  138-139

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中图分类: > 数理科学和化学 > 化学 > 分析化学 > 仪器分析法（物理及物理化学分析法） > 光化学分析法（光谱分析法）
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