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小鼠附睾特异β-defensin15蛋白表达及多克隆抗体制备的研究

作　者: 邹美
导　师: 胡建民；张永莲
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: β-defensins 15(mBD15) 小鼠附睾蛋白表达多克隆抗体
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

附睾是精子成熟和储存的重要场所,精子在穿越附睾的过程中与不断变化的附睾微环境相互作用而逐渐成熟,获得运动和受精的能力,而附睾特殊的微环境变化归因于附睾基因的表达和调控的结果。β-defensins是重要的天然免疫分子,不仅参与抗微生物天然免疫、抗病毒、趋化和免疫增强作用,还在细胞分化、肿瘤发展、组织重构等过程中发挥广泛的功能。迄今在小鼠报道了53个β-defensins,其中18个成员主要在雄性生殖系统表达,而且在附睾中的表达具有区段特异性。如此众多的β-defensin在生殖系统,尤其是附睾内特异表达,暗示了它们在精子成熟以及运动等方面的重要作用。深入研究这些小分子多肽的生理功能,或许会为男性避孕找到新的靶点。小鼠β-defensin 15(mBD15),最初是Zaballos等利用生物信息学方法,在小鼠基因组8号染色体上发现的成簇β-defensins中的成员,其mRNA特异性在附睾头部表达,但是对于其蛋白水平的表达特性和生理功能的研究,目前国际上还未见报道。我们首先成功克隆了小鼠mBD15的cDNA全长序列,RT-PCR检测了mRNA的组织表达谱,发现其特异在附睾头部表达,体部微弱表达;Real time PCR检测了mBD15mRNA在发育过程中的表达变化,发现其从3周龄开始表达,8周龄表达量显著升高。为了能在体外研究mBD15的功能,我们利用内含肽介导的IMPACT-TWIN融合表达系统在E.coli中成功表达并且纯化到了mBD15的活性蛋白。圆二色性分析表明,该蛋白具有良好的二级结构;肉汤稀释法检测mBD15蛋白具有抗E.coli的活性,对附睾常见的病原菌的抗性正在检测中。从蛋白质水平深入研究mBD15的表达特性及其生理功能,需要有良好的抗体。我们在大肠杆菌中以包含体的形式表达了双拷贝串联的mBD15,回收包含体后,通过凝胶蛋白电泳及电洗脱纯化该目的蛋白,并将纯化的目的蛋白免疫兔子,得到了mBD15兔源的多克隆抗体。经Western blotting检测证明其灵敏度和特异性均非常好,仅能在附睾头部蛋白提取物中检测到一个大约7kDa的条带。通过免疫组织化学的方法,发现mBD15蛋白主要表达在附睾头部区域的上皮细胞内。另外,通过软件预测了mBD15四段siRNA,并成功构建了shRNA-hH1表达载体中,正在转染细胞筛选有效片段。全文工作为建立基因过表达、基因敲除或整体RNAi等动物模型,进一步研究mBD15生理功能打下了基础。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
第一章前言  10-26
  1.1 附睾的基本概况  11-20
  1.2 β-defensin研究概况  20-24
  1.3 研究目的及意义  24-26
第二章小鼠β-defensin15 cDNA克隆、蛋白表达及抗菌检测  26-48
  2.1 材料  26
  2.2 方法  26-36
  2.3 结果与分析  36-45
  2.4 讨论  45-47
  2.5 小结  47-48
第三章兔源mBD15多克隆抗体的制备及其功能探索  48-68
  3.1 材料  48-49
  3.2 方法  49-57
  3.3 结果与分析  57-63
  3.4 讨论  63-66
  3.5 小结  66-68
第四章结论  68-69
参考文献  69-74
附录  74-76
致谢  76-78
攻读学位期间发表论文  78

小鼠附睾特异β-defensin15蛋白表达及多克隆抗体制备的研究

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