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通过兔单克隆抗体筛选胚胎干细胞特异性分子标志的研究

作　者: 李颖
导　师: 张铭
学　校: 浙江大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 分子标志单克隆抗体特异性硕士研究生自我更新成体组织毕业论文分泌抗体浙江大学杂交瘤细胞株
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)是指从胚胎内细胞团分离获得的,能在体外长期培养并保持自我更新能力和分化为所有三个胚层细胞潜能的正常二倍体细胞。ES细胞是细胞治疗和组织工程的理想种子细胞来源,可应用于药物筛选,还是很好的研究胚胎早期分化的模型系统。胚胎干细胞的高度自我更新能力和分化全能性是它区别于其它细胞的重要特征,它的特异性分子标志,对于胚胎干细胞的鉴定、分离以及自我更新和分化机制的研究,有着十分重要的意义。尤其是细胞表面分子标志,与细胞外信号系统和细胞间通讯联系密切相关,受到广泛关注。但是目前发现的ES细胞分子标志数量有限,而且与其他的成体干细胞或肿瘤细胞有共同的表达,因此更多更特异的胚胎干细胞分子标志仍有待发现。胚胎干细胞特异性分子,尤其是膜表面特异分子,具有丰度低、修饰复杂和变化快的特点;胚胎干细胞培养系统复杂,不易大规模培养,加之它的群体异质性更增加了特异性分子标志的研究难度。目前研究胚胎干细胞特异性分子标志的方法主要基于单克隆抗体技术、转录组学技术和蛋白组学技术。我们实验室使用小鼠ES细胞免疫兔,筛选ES细胞特异的兔单克隆抗体,通过免疫共沉淀和质谱技术结合的方法鉴定抗原来筛选胚胎干细胞的特异性分子标志。目前常用的大部分胚胎干细胞分子标志SSEA-1、SSEA-3、TRA-1-60等并不是直接从胚胎干细胞获得的,而且所用的免疫动物大多为小鼠。与鼠单抗相比,兔单抗具有更大的优势:首先,兔对外源抗原反应更为敏感,可以对小鼠无免疫原性的抗原产生抗体;其次,兔单克隆抗体具有更高的亲和力;第三,对同一种抗原,兔单抗会识别更多不同的表位;第四,兔的脾脏更大,可以产生更多的脾细胞进行融合实验,有机会筛选到更多的单克隆抗体。通过ES细胞免疫兔的方法可以获得大量分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株从而建立胚胎干细胞的抗体库,并可能率选到新的胚胎干细胞分子标志。在本次实验中,我们共筛选到了200多株胚胎干细胞特异性的杂交瘤,并选择了其中20株进一步进行亚克隆,最后获得了14株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。大部分抗体对胚胎干细胞有特异性结合,并且具有一定的组织表达特异性。细胞免疫荧光和免疫组织化学得结果显示:多数抗体具有较高的特异性,仅在少数成体组织或其它细胞系中有染色现象,并且多数抗体的染色在ES细胞分化后会出现染色变弱或消失的现象,说明这些抗体所针对的抗原随着ES的分化表达降低,这些抗原很有可能会成为未分化胚胎细胞的分子标志。尤其是其中一株杂交瘤59#,它所分泌的抗体只在ES细胞中有阳性染色,其抗原在成体组织中未发现表达,甚至在畸胎瘤细胞中也未发现表达,可能会成为一个很好的胚胎干细胞的特异标志。对其中一株9#杂交瘤分泌抗体的研究表明,该抗体所针对的抗原是三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-triphosphate receptor)。它位于细胞内质网膜上,与内质网上的钙离子释放有关。其它抗体仍在进一步的鉴定过程中。

全文目录

致谢  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
背景介绍  10-12
一.实验部分:  12-49
  1.材料和方法  12-28
    材料  12-17
      1.1 实验材料、试剂及仪器  12-14
      1.2 主要试剂配制方法  14-17
    实验方法  17-28
      1.3 细胞培养  17-19
      1.4 细胞免疫  19-20
      1.5 单克隆抗体的制备  20-21
      1.6 杂交瘤分泌抗体特异性的初步鉴定  21-22
      1.7 Westernblot  22-24
      1.8 免疫共沉淀  24-27
      1.9 质谱分析  27-28
  2.实验结果  28-42
    1. 抗体的制备和筛选  28-30
    2. 抗体的鉴定  30-42
      2.1 不同细胞系的ICC染色  30-33
      2.2 成体组织的IHC染色  33-39
      2.3 Westernblot鉴定抗原分子量  39
      2.4 免疫共沉淀  39-40
      2.5 质谱鉴定抗原  40-42
  3.实验讨论  42-46
  4.参考文献  46-49
二.综述部分:  49-61
  中文摘要  49
  正文  49-57
    前言  49
    1.胚胎干细胞特异性分子标志的研究方法  49-52
    2.胚胎干细胞的分子标志  52-55
    3.应用及展望  55-57
  参考文献  57-60
  英文摘要  60-61
三.附录  61
  缩略词表  61

通过兔单克隆抗体筛选胚胎干细胞特异性分子标志的研究

内容摘要

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