学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

树鼩原代肝细胞分离培养及HCV对其感染性研究

作　者: 高丽
导　师: 夏雪山
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 树鼩原代肝细胞分离细胞培养丙型肝炎病毒感染
分类号: R512.63
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 94次
引　用: 2次
阅　读: 论文下载

内容摘要

丙型肝炎流行广泛、危害严重。全球约有1.7～2.0亿(约3%)人口感染HCV,我国HCV感染人数约4000多万,占总人口的2～3%。高效的病毒培养体系和合适小动物模型的缺乏,严重阻碍了我们对病毒病原学及其感染机制的了解,使丙型肝炎疫苗和抗病毒药物的研究与开发举步维艰。树鼩(tree shrew,Tupaia belangeri)是一种体形小、繁殖快、易于饲养、广泛分布于我国西南部及东南亚一带、在分类学上介于食虫目和灵长目之间的动物,已知对多种医学病毒易感。树鼩对丙型肝炎病毒的易感性已被多项国内外研究结果所证实,有希望成为丙型肝炎研究的动物模型。树鼩原代肝细胞分离培养及其对HCV的易感性确定,是建立丙型肝炎树鼩动物模型的重要组成部分,并可为研究丙型肝炎病毒感染与疾病慢性化机制,及疫苗研制与药物开发提供必要工具。本研究以经驯化的野生树鼩为对象,采用半原位的二步灌流、胶原酶消化法分离获得树鼩原代肝细胞,并成功进行了培养。实验采用血液循环同向的门静脉——下腔静脉灌流方向,以无钙镁的Hepes液为预灌流液灌流至肝脏灰白色、血细胞冲洗干净,以0.025%的胶原酶Ⅳ溶液为消化液,灌流速度为5～20ml/min;胶原酶37℃消化18分钟为宜,可以得到散在的树鼩肝细胞。经洗涤离心,每次分离细胞产量达5×10~8以上,细胞纯度达95%以上,细胞成活率为90%,可以满足细胞培养和HCV感染试验要求。对分离得到的树鼩原代肝细胞用多种培养基进行培养,经细胞生长形态观察,确定MEM+5%NCS+10ng/ml EGF+10ng/ml HGF为最佳培养基,适合树鼩原代肝细胞的长期培养。培养过程中,细胞经2天左右的潜伏期,很快进入对数增长期,第3至第8天细胞增殖与生长状态最好,经定期补充培养基,细胞成活可达25天之久。采用常规的细胞胰酶消化传代、血清-DMSO冻存和复苏方法,对树鼩原代肝细胞进行传代与复苏,但传代细胞再次贴壁效果不好,复苏细胞几乎不再贴壁,方法有待改进。用经质粒转染Hela细胞培养获得的HCV病毒,感染生长良好的树鼩原代肝细胞,经HCV特异性正链、负链检测发现:在培养上清中,从第1天到第18天可以间歇性地检测到HCV RNA正链;在培养细胞中,从第3天到第15天可以间歇性地检测到HCVRNA负链。采用含有绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因、Luciferase(荧光素酶)基因的HCVpp和HCVcc来感染树鼩原代肝细胞,在荧光显微镜下可以观察到HCVpp-EGFP感染细胞发出的绿色荧光,HCVpp-Luciferase感染的细胞经荧光素酶检测为阳性,同时通过免疫荧光检测证实了HCV抗原在感染细胞中的存在。本研究建立了成熟的树鼩原代肝细胞分离、培养方法,初步证实了培养的树鼩原代肝细胞对不同来源、特性的HCV病毒的易感性,为HCV感染机制研究、药物、疫苗的研发奠定了基础,并为树鼩可以成为丙型肝炎动物模型提供了佐证。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-13
第一章绪论  13-26
  1.1 丙型肝炎与丙型肝炎病毒(HCV)  13-16
    1.1.1 丙型肝炎的病原学  13-14
    1.1.2 丙型肝炎的传播与流行  14
    1.1.3 丙型肝炎的自然史  14-15
    1.1.4 丙肝的治疗及药物研究进展  15-16
  1.2 树鼩  16-17
  1.3 HCV体外培养系统  17-19
  1.4 原代肝细胞培养  19-24
    1.4.1 肝细胞培养方式  19-20
    1.4.2 原代肝细胞培养基中的添加物  20-22
    1.4.3 原代细胞的纯化  22-23
    1.4.4 国内外HCV感染的研究状况  23-24
  1.5 本研究的目的与意义  24-25
  1.6 总实验技术路线图  25-26
第二章树鼩原代肝细胞的分离  26-39
  2.1 引言  26
  2.2 材料与方法  26-29
    2.2.1 实验材料  26-27
    2.2.2 实验方法  27-29
  2.3 结果  29-33
    2.3.1 最佳的分离方式与条件  29-31
    2.3.2 离心方式与肝细胞的获得  31-32
    2.3.3 肝细胞分离结果  32-33
  2.4 讨论  33-37
    2.4.1 肝细胞分离方法  33-34
    2.4.2 理想的灌流方式、灌流液的选择及灌流速度  34-35
    2.4.3 胶原酶浓度与作用时间  35-36
    2.4.4 离心方式  36
    2.4.5 其它  36-37
  2.5 本章小结  37-39
第三章树鼩原代肝细胞的培养、冻存及复苏  39-57
  3.1 引言  39
  3.2 材料与方法  39-45
    3.2.1 主要材料  39
    3.2.2 实验方法  39-45
  3.3 结果  45-53
    3.3.1 培养条件的最优化  45-49
    3.3.2 树鼩原代肝细胞活力测定结果  49-51
    3.3.3 树鼩原代肝细胞的纯化  51
    3.3.4 树鼩原代肝细胞的首次传代  51-52
    3.3.5 树鼩原代肝细胞最适的冻存与复苏  52-53
  3.4 讨论  53-56
    3.4.1 培养液成分的最优化  53-54
    3.4.2 细胞活力检测  54-55
    3.4.3 原代细胞的冻存与复苏  55-56
  3.5 本章小结  56-57
第四章 HCV对树鼩原代肝细胞的感染性研究  57-73
  4.1 引言  57
  4.2 材料与方法  57-65
    4.2.1 主要材料  57-58
    4.2.2 实验方法  58-65
  4.3 结果  65-70
    4.3.1 HCVcc感染结果  65-67
    4.3.2 接种HCVpp-EGFP观察结果  67-68
    4.3.3 免疫荧光检测HCV抗原的表达  68-69
    4.3.4 荧光素酶检测  69-70
  4.4 讨论  70-72
    4.4.1 感染时间与感染滴度  70
    4.4.2 定性检测确定感染  70-71
    4.4.3 其它  71-72
  4.5 本章小结  72-73
第五章结论与展望  73-76
  5.1 结论  73-74
    5.1.1 确定了半原位胶原酶二步灌流法  73
    5.1.2 找到适合树鼩原代肝细胞长期培养的培养基  73
    5.1.3 建立了比较成熟的树鼩原代肝细胞培养方法  73
    5.1.4 初步确定HCV可成功感染树鼩原代肝细胞  73-74
  5.2 存在问题及课题展望  74-76
致谢  76-77
参考文献  77-85
附录A  85

树鼩原代肝细胞分离培养及HCV对其感染性研究

内容摘要

全文目录

相似论文