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秀丽线虫缺氧相关基因可变剪接变体的研究

作　者: 严瑞芬
导　师: 刘虎岐；张成岗
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 缺氧 可变剪接 低丰度基因 秀丽线虫 巢式PCR 两步反转录法
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


氧气是生物体维持生命活动的基础,缺氧会使生物机体发生损伤甚至导致相关疾病的发生,生物体对低氧的适应性调节是通过一系列基因表达变化来实现的。94%的人类基因都会发生可变剪接,可变剪接作为调节多细胞动物组织中基因表达多样性的一个重要机制与癌症在内的很多疾病相关联,很多缺氧相关基因也是以不同剪接变体参与缺氧应答并发挥重要的调控作用。同时,越来越多的证据表明低丰度基因在重要的生理和病理过程中起着举足轻重的作用,然而由于低丰度基因的低转录本和高异质性,导致人们对于低丰度基因转录本的认识目前还处于一个初始阶段。为了探索不同丰度基因可变剪接形式的变化,进而明确基因剪接变体与人类健康的联系,本课题进行了以下研究:首先,以模式生物秀丽线虫中不同丰度的和缺氧相关的基因(HIF-1、egl-9、glb-3、glb-5、glb-8、glb-13、glb-18)为研究对象,利用基因特异引物GSP反转录结合巢式PCR,实现了对上述七个基因已知剪接变体的鉴定,并利用该方法发现了glb-18基因的一个未知剪接变体。该方法不仅快速、高效,省时省力,而且能检测基因已知剪接变体和发现基因未知剪接变体,为转录组学和剪接组学的研究提供新的大量参考数据。其次,利用基因特异引物GSP反转录结合巢式PCR方法检测了秀丽线虫物理缺氧前后HIF-1、egl-9、glb-3、glb-8、glb-13等基因剪接变体的变化。结果显示,物理缺氧前后各基因表达出现上调或下调的变化,说明基因剪接变体与缺氧密切相关,进一步验证了在生物体生长发育的不同阶段和接受缺氧刺激前后基因剪接变体的职能不同这一说法。再次,鉴于低丰度基因的低转录本和高异质性,我们又以秀丽线虫actin-1,egl-9,hif-1,glb-18和C57小鼠TrkC等不同丰度基因为研究对象,利用两步反转录法对基因的表达效率进行了研究。结果显示该方法显著提高了基因表达检测效率。两步反转录法的提出不仅实现了对低丰度基因的富集,更为低丰度基因剪接变体的研究奠定了坚实的基础。综上所述,本课题为基因可变剪接变体的研究和低丰度基因的研究提供了新的参考方法,为缺氧相关疾病的基因研究提供了重要线索。

全文目录


摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
第一章 文献综述  10-16
  1.1 可变剪接概述  10-13
    1.1.1 可变剪接机制及其剪接方式  10-12
    1.1.2 可变剪接与人类健康  12-13
  1.2 研究背景、目的和研究意义  13-16
    1.2.1 国内外研究现状分析及存在问题  13-14
    1.2.2 秀丽线虫体内HIF-1、egl-9 基因和珠蛋白家族(globin family)基因在缺氧应答中的调控作用  14-15
    1.2.3 研究目的及意义  15-16
第二章 利用GSP反转录结合巢式PCR扩增技术鉴定秀丽线虫缺氧相关的不同丰度基因可变剪接变体的研究  16-26
  2.1 材料和方法  16-20
    2.1.1 材料  16
    2.1.2 方法  16-20
  2.2 结果与分析  20-24
    2.2.1 GSPs 引物设计及合成  20-22
    2.2.2 巢式PCR 结果  22-23
    2.2.3 测序验证  23
    2.2.4 基因新变体序列信息的整理和数据库提交  23-24
  2.3 讨论  24-26
第三章 利用GSP反转录结合差异巢式PCR鉴定秀丽线虫物理缺氧前后缺氧相关基因剪接变体变化的研究  26-34
  3.1 材料  26-27
    3.1.1 实验动物  26
    3.1.2 实验试剂及实验仪器  26-27
  3.2 方法  27-29
    3.2.1 秀丽线虫的饲养  27
    3.2.2 秀丽线虫的同步化培养  27
    3.2.3 秀丽线虫的物理缺氧  27
    3.2.5 物理缺氧前后核算水平的实验检测  27-29
  3.3 结果与分析  29-32
    3.3.1 引物设计及合成  29-30
    3.3.2 巢式引物检测不同基因剪接变体在物理缺氧不同时间mRNA表达水平的变化  30-32
  3.4 讨论  32-34
第四章 两步反转录法与常规反转录法检测基因表达效率的实验研究  34-39
  4.1 材料与方法  34-36
    4.1.1 材料  34
    4.1.2 方法  34-36
  4.2 结果与分析  36-37
    4.2.1 GSPs 引物设计及合成  36-37
    4.2.2 PCR 结果  37
  4.3 讨论  37-39
第五章 结论  39-40
参考文献  40-45
附录  45-49
致谢  49-50
作者简介  50

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学
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