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耐药整合子细菌在水环境中的散播调查及其多样性分析

作　者: 国宪虎
导　师: 徐海
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 整合子 基因水平转移 基因盒 耐药性机制 抗性谱 水环境
分类号: Q938
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 21次
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内容摘要


近年来抗生素在临床治疗及畜牧养殖等方面的滥用,造成了巨大的环境选择压力,使得细菌的耐药以至多重耐药问题日益严重,耐药机制日趋复杂,业已成为临床治疗的难题,其耐药机制、耐药基因的广泛传播及转移是近年来国内外研究的热点。细菌中存在一种能捕获和表达基因的遗传单位—整合子,其在细菌获得耐药机制中具有重要作用。整合子是一种能通过自身编码的整合酶识别、捕获、整合或剪切细胞外游离基因或基因片段,尤其是耐药基因,并使其得以表达的位点特异性重组系统。整合子本身虽无法移动,但其通常位于具有广泛宿主的可移动元件如接合型质粒、转座子、整合型噬菌体等上,随其发生水平基因转移。整合子根据整合酶基因序列的不同通常分为五类。1型整合子在细菌间散播抗药性的作用最为突出和常见,其通常包括5’保守区,3’保守区以及夹在两保守区之间的可变区,在可变区往往整合有多重耐药基因盒。常见的耐药基因盒种类有编码氨基糖苷类抗生素修饰酶的耐药基因：aac, aad, aphA;编码P-lactamases的耐药基因bla；编码氯霉素乙酰转移酶的耐药基因：cat, cml等。过去对整合子多样性的研究侧重从临床分离的耐药菌株上,尤其是肠杆菌属。然而自然水环境中也存在着丰富的耐药菌,有些是来自于人类或畜类的致病或条件致病菌,它们在水环境条件下相互接触,其携带的耐药基因及相关的遗传元件就有可能发生水平转移,容易产生多重抗药性或重组产生新的抗药基因；然后通过食物链或其它方式感染人类,对细菌感染疾病的治疗有强烈的阻碍作用。本论文主要从自然废水环境中分离筛选整合子细菌；调查废水中整合子细菌的发生率及其含有的耐药基因盒种类；分析整合子与细菌耐药性在特定种类抗生素的耐药菌株中是否存在显著性差异；发掘、鉴定了一些新型的整合子结构,并从基因水平上分析了细菌的耐药及其转移机制,说明抗菌药物滥用的危害性从而指导抗菌药物的正确使用,防止抗菌药物的滥用。本研究具体从济南地区医院周边七个自然废水点采集水样,采用膜过滤后富集培养,梯度稀释涂布含有不同种类和浓度的抗菌药物筛选平板,根据菌落特征、药敏试验得到的抗性谱差异等标准筛得无重复耐药菌株247株。以整合酶基因序列的不同检测247株耐药菌株所含整合子类型。本研究在所筛189株含有1型整合酶的阳性菌株中,检测到41种不同的基因盒,29种不同的1型基因盒阵列,其中鉴定出7种世界尚未报道过的新型基因盒阵列包括：orfⅠ(693bp);aadB—cat—blaOXA-10—aadA1—crfⅡ-unknown (5193bp);catB8—linF(1877bp);aadB—cat—blaOXA-10—aadA1—dfrA1—aacA4 (4336bp);arr-3—dfrA27 (1393bp);dfrA1—aadB—aphA15—catB3—blaOXA-1—aadA15 (4797bp); dhfrV—aac(6’)-Ⅱ—nit1—nit2—catB3—blaOXA-1(3800bp)。在32株2型整合酶阳性菌株中,检测到6种基因盒,5种2型基因盒阵列,其中3种为新型基因盒阵列：linF—dfrA1—aadA1 (2460bp);dfrA1—catB2—sat2—aadA1 (2892bp);linF—dfrA1—aadA1—orf441 (4297bp)。并且鉴定了通常位于整合子之外的耐药基因种类。接合实验及转化实验验证了整合子及其常见耐药基因的可移动性。本研究中还发明了一种利用限制性内切酶(?)(?)coRⅡ对细菌整合子中基因盒阵列PCR扩增产物进行酶切构建酶切图谱库,通过EcoRⅡ酶切图谱库实现快速经济检测整合子细菌中基因盒阵列的方法。

全文目录


摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
缩略符号说明  13-14
第一章 前言  14-31
  1.1 细菌耐药的现状  15-16
  1.2 细菌常见的耐药机制  16-18
    1.2.1 细菌改变细胞膜通透性  16
    1.2.2 细菌生物被膜的形成  16-17
    1.2.3 细菌主动药物外排机制  17
    1.2.4 细菌产生灭活酶或钝化酶  17-18
    1.2.5 细菌药物作用靶位改变  18
  1.3 细菌耐药的危害及防控措施  18-19
  1.4 整合子-基因盒系统  19-26
    1.4.1 整合子定义及简介  20
    1.4.2 整合子的典型结构  20-22
    1.4.3 整合子的分类  22-23
    1.4.4 基因盒的结构、种类及起源  23-25
      1.4.4.1 基因盒的结构  23-24
      1.4.4.2 基因盒的种类  24
      1.4.4.3 基因盒的来源  24-25
    1.4.5 整合子对基因盒捕获、剪切及表达  25-26
  1.5 细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药  26-29
    1.5.1 β-内酰胺酶的种类其性质  26-28
      1.5.1.1 超广谱β-内酰胺酶(ESBLS)  27
      1.5.1.2 头孢菌素酶(AmpC酶)  27
      1.5.1.3 金属β-内酰胺酶(MBL)  27-28
      1.5.1.4 碳青霉烯酶(carbapenemases)  28
    1.5.2 PBP及细菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制  28-29
      1.5.2.1 青霉素结合蛋白(PBPs)  29
      1.5.2.2 β-内酰胺类抗生素耐药机制  29
  1.6 立题依据及意义  29-31
第二章 耐药菌株的筛选及其药敏实验  31-41
  2.1 引言  31
  2.2 材料和方法  31-37
    2.2.1 实验材料  31-34
      2.2.1.1 样品采集  31-32
      2.2.1.2 培养基(Medium)  32-33
      2.2.1.3 筛选耐药细菌所用抗生素的配制及保存方法  33
      2.2.1.4 实验主要试剂及对照菌种  33-34
      2.2.1.5 主要仪器  34
    2.2.2 实验方法  34-37
      2.2.2.1 取样及耐药细菌的筛选  34-35
      2.2.2.2 K-B纸片琼脂扩散法检测细菌药物敏感试验  35-37
  2.3 结果与讨论  37-39
    2.3.1 七批样品水样耐药菌株的筛选  37-38
    2.3.2 各批次样品水样耐药菌株的筛选  38-39
  2.4 本章小结  39-41
第三章 247株耐药菌株1、2、3型整合子的检测及分析  41-52
  3.1 引言  41
  3.2 材料与方法  41-46
    3.2.1 实验材料  41-43
      3.2.1.1 实验样品  41-42
      3.2.1.2 实验溶液  42
      3.2.1.3 实验试剂及仪器  42-43
    3.2.2. 实验方法  43-46
      3.2.2.1 CTAB法提取细菌基因组DNA  43-44
      3.2.2.2 PCR扩增检测1型,2型及3型整合酶  44-45
      3.2.2.3 琼脂糖凝胶电泳  45-46
      3.2.2.4 含1型整合子细菌与不含1型整合子细菌抗性谱结果的统计学分析  46
  3.3 实验结果与讨论  46-50
    3.3.1 CTAB法提取基因组DNA及其质量检测  46-48
    3.3.2 PCR检测耐药细菌中所携带的整合子类型  48-49
    3.3.3 含1型整合子细菌与不含1型整合子抗性谱结果的统计学分析  49-50
  3.4 本章小结  50-52
第四章 建立基因盒阵列EcoRⅡ酶切图谱库  52-65
  4.1 引言  52
  4.2 材料与方法  52-59
    4.2.1 实验材料  52-53
      4.2.1.1 实验菌株及质粒  52
      4.2.1.2 实验试剂  52-53
    4.2.2 实验方法  53-59
      4.2.2.1 PCR扩增1型整合子可变区所含基因盒阵列  53-54
      4.2.2.2 PCR检测位于基因盒阵列之外的耐药基因  54-55
      4.2.2.3 DNA片段的切胶回收、纯化及连接  55
      4.2.2.4 氯化钙改良法制备高效感受态细胞  55-56
      4.2.2.5 用于电转化感受态细胞的制备  56
      4.2.2.6 常规热激转化实验  56-57
      4.2.2.7 电转化实验  57
      4.2.2.8 碱法小提质粒  57-58
      4.2.2.9 重组质粒的筛选、鉴定及测序  58-59
  4.3 结果与讨论  59-63
    4.3.1 1 型整合子可变区所含基因盒阵列的检测  59-61
    4.3.2 建立基因盒阵列EcoRⅡ酶切图谱库  61-63
      4.3.2.1 寻找合适的限制性内切酶消化基因盒阵列  61
      4.3.2.2 利用EcoRⅡ酶切图谱库检测细菌整合子中基因盒阵列的方法简介  61-63
      4.3.2.3 EcoRⅡ酶切建库分析基因盒阵列的意义及应用  63
  4.4 本章小结  63-65
第五章 1型整合子细菌中基因盒阵列多样性检测及分析  65-71
  5.1 引言  65
  5.2 材料与方法  65-66
    5.2.1 实验材料  65
      5.2.1.1 实验菌株及质粒  65
      5.2.1.2 实验试剂  65
    5.2.2 实验方法  65-66
  5.3 结果与讨论  66-69
    5.3.1 1型整合子可变区所含基因盒阵列的检测  66-68
    5.3.2 同一菌株含有多种基因盒阵列  68
    5.3.3 新型基因盒阵列的筛选  68-69
  5.4 本章小结  69-71
第六章 2型整合子细菌中基因盒阵列多样性检测及分析  71-83
  6.1 引言  71
  6.2 材料与方法  71-74
    6.2.1 实验材料  71
      6.2.1.1 实验菌株  71
      6.2.1.2 实验试剂  71
    6.2.2 实验方法  71-74
      6.2.2.1 2型整合子可变区基因盒的检测及其测序  71-72
      6.2.2.2 2型整合子可变区基因盒分析及其它整合子外耐药基因的检测  72
      6.2.2.3 接合转移实验进行2型整合子定位  72-74
  6.3 结果与讨论  74-77
    6.3.1 2型整合子菌株中所含的基因盒阵列  74
    6.3.2 三种位于Tn7转座子家族中新型2型基因盒阵列的分析  74-76
    6.3.3 1型整合子及位于整合子外耐药基因的检测  76
    6.3.4 运用EcoRⅡ建立2型基因盒阵列酶切图谱库  76-77
    6.3.5 接合转移实验定位2型整合子  77
    6.3.6 32株2型整合酶阳性的菌株抗性谱实验  77
  6.4 本章小结  77-83
第七章 含有新型基因盒阵列1型整合子细菌的研究  83-90
  7.1 引言  83
  7.2 材料与方法  83-84
    7.2.1 实验材料  83
      7.2.1.1 实验菌株  83
      7.2.1.2 实验试剂  83
    7.2.2 实验方法  83-84
      7.2.2.1 七株含新型基因盒阵列菌株菌种的鉴定  83
      7.2.2.2 七株含新型基因盒阵列菌株的接合转移实验及质粒转化实验  83-84
      7.2.2.3 接合子的药敏实验  84
      7.2.2.4 整合子外耐药基因的检测与分析  84
  7.3 结果与讨论  84-89
    7.3.1 七株含新型基因盒阵列菌株菌种的鉴定  84-85
    7.3.2 七株新型基因盒阵列的分析  85-86
    7.3.3 新型基因盒lin的比对分析  86
    7.3.4 七株含新型基因盒阵列菌株整合子外耐药基因的检测  86-87
    7.3.5 七株含新型基因盒阵列菌株的接合转移及转化实验  87-89
  7.4 本章小结  89-90
第八章 全文总结  90-92
参考文献  92-98
致谢  98-99
攻读硕士学位期间发表的学术论文  99-100
附件  100-120
学位论文评阅及答辩情况表  120

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生态学和地区分布
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