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牛源大肠杆菌耐药性及耐药机制研究

作　者: 王宏
导　师: 张秀英
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 大肠杆菌耐药性耐药机制脉冲场凝胶电泳
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

致病性大肠杆菌是引起犊牛白痢的主要病原菌,近年来其耐药性在全球普遍呈迅速上升趋势。许多国家和地区通过对犊牛白痢的流行病学调查和牛源大肠杆菌的耐药性监测,积累了翔实的牛源大肠杆菌耐药性及其流行资料,并结合分子生物学方法研究了牛源大肠杆菌耐药性的传播规律,这些研究对所在地区犊牛白痢的防治和治疗发挥了重要作用。黑龙江省关于牛源大肠杆菌的研究较少,尤其犊牛大肠杆菌的耐药性及其传播仍缺乏详细的研究资料。为此,我们对黑龙江周边地区养牛场的大肠杆菌进行了分离鉴定,对耐药谱和耐药基因进行了研究,并比较了基因分型和耐药表型的相关性。本研究采用细菌学方法分离鉴定大肠杆菌,采用WHO推荐的K-B纸片法研究不同来源的菌株对13种抗菌药物的敏感性。获得26株犊牛源耐药大肠杆菌。这些耐药菌对8种药物产生了耐药性,其中牛源大肠杆菌对链霉素、阿莫西林、四环素、复方新诺明和多西环素的耐药率较高,对前四种药物的耐药率达到了100%,对多西环素的耐药率也高达96.15%;但耐药菌株对庆大霉素、丁胺卡那霉素、多粘菌素B和新霉素表现为100%敏感,对恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星和氯霉素耐药程度较低,耐药率分别为3.85%、8.89%和11.54%和19.23%。由此可见,养牛场大肠杆菌分离株的多重耐药现象较严重。本研究考察了不同型别ESBLS基因CTX-M、TEM、SHV在以上分离菌株中的流行情况,结果发现:blaCTX-M基因检出的阳性率为19.23%;blaTEM基因检出的阳性率为84.62%;blaSHV基因未检出。发现质粒介导的ESBLS的产生和传播是导致分离菌株对β-内酰胺类抗菌药物耐药的重要机制;耐药菌株中检出2种氨基糖苷类乙酰基转移酶基因,aadA1基因检出的阳性率为73.33%,aac(3)-Ⅱ基因检出的阳性例率为11.54%。aadA1基因主要对链霉素产生耐药性,结果表明对氨基糖苷类耐药的主要机制是细菌产生氨基糖苷类修饰酶;氯霉素耐药基因检测结果显示:cmlA基因检出的阳性率为45.15% ,floR基因检出的阳性率为19.23%。这些耐药菌株的出现势必给临床治疗带来困难。应注意临床合理用药,控制耐药趋势的发展。采用PCR技术从耐氟喹诺酮类药物的大肠杆菌中选取4株扩增了GyrA基因、GyrB基因和ParC基因的喹诺酮耐药决定区(QRDR)。通过PCR产物发现A7菌株GyrA亚基发生了Ser83→Leu的氨基酸替代;4株菌ParC亚基上发生了Ser80→Arg、Ile氨基酸替代类型,并且证明GyrA、ParC亚基上发生的氨基酸替代是该地区耐药菌对氟喹诺酮类药物产生耐药性的主要机制之一。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对牛源耐药大肠杆菌进行研究,并将其结果与耐药表型结果进行比较。结果表明:26株菌可分为A~G共10型,其中B型被分了B1、B2和B3三个亚型。试验结果表明耐药表型和基因图谱并不是完全对应关系,但耐药表型相同的菌株其PFGE电泳图谱相同的概率较高,同一养殖场不同耐药表型的菌株都存在PFGE指纹图谱完全相同菌株,相同PFGE分型的菌株其耐药谱型不一定相同。试验证明养殖场动物之间存在多重耐药大肠杆菌的克隆传播。

全文目录

摘要  8-9
英文摘要  9-11
1. 引言  11-23
  1.1 研究的目的与意义  11
  1.2 文献综述  11-23
    1.2.1 大肠杆菌病的危害  12-14
    1.2.2 抗微生物药物的研究概况  14-15
    1.2.3 E.coli 耐药性研究进展  15-20
    1.2.4 脉冲场凝胶电泳（PFGE）  20-23
2. 材料与方法  23-35
  2.1 试验材料  23-25
    2.1.1 菌株  23
    2.1.2 试剂  23
    2.1.3 主要试剂的配制  23-24
    2.1.4 主要仪器与设备  24-25
  2.2 方法  25-35
    2.2.1 大肠杆菌的分离  25
    2.2.2 大肠杆菌的鉴定  25-26
    2.2.3 大肠杆菌的体外药物敏感性实验  26-27
    2.2.4 DNA 的提取  27-28
    2.2.5 耐药大肠杆菌主要耐药基因的扩增  28-31
    2.2.6 PCR 产物电泳分析及回收  31-32
    2.2.7 目的片段基因测序的确定  32
    2.2.8 耐药大肠杆菌脉冲场凝胶电泳分型  32-35
3. 结果  35-49
  3.1 大肠杆菌的分离鉴定及其耐药性研究  35-39
    3.1.1 大肠杆菌分离情况  35-36
    3.1.2 大肠杆菌的体外药物敏感实验  36-39
  3.2 耐药大肠杆菌中耐药基因的分析  39-46
    3.2.1 耐药大肠杆菌中超广谱β-内酰胺酶基因的检测结果  39-41
    3.2.2 耐药大肠杆菌中氨基糖苷酰基转移酶基因的检测  41-42
    3.2.3 大肠杆菌氯霉素耐药基因的分析  42-43
    3.2.4 耐药大肠杆菌氟喹诺酮类耐药株基因突变研究  43-46
  3.3 犊牛源大肠杆菌PFGE 电泳的结果  46-49
    3.3.1 PFGE 图谱类型相同  47
    3.3.2 耐药表型相同  47-49
4. 讨论  49-57
  4.1 不同养牛场菌株对敏感药物的差异  49
  4.2 大肠杆菌耐药现状及分析  49-50
  4.3 控制大肠杆菌耐药性的对策  50
  4.4 犊牛源耐药大肠杆菌中超广谱β-内酰胺酶基因的分析  50-51
    4.4.1 关于检测基因的选择  50
    4.4.2 耐药基因与耐药表型的关系  50-51
  4.5 犊牛源大肠杆菌中氨基糖苷酰基转移酶基因的分析  51-52
    4.5.1 关于检测基因的选择  51
    4.5.2 耐药基因与耐药表型的关系  51-52
  4.6 犊牛源大肠杆菌氯霉素耐药基因的研究  52-53
  4.7 犊牛源大肠杆菌氟喹诺酮类耐药株基因突变研究  53-55
    4.7.1 GyrA 基因片段测序结果与分析  53-54
    4.7.2 GyrB 基因片段测序结果分析  54
    4.7.3 ParC 基因片段测序结果分析  54-55
  4.8 PFGE 图谱、耐药表型的相关性比较  55-57
    4.8.1 选择PFGE 电泳的依据  55
    4.8.2 PFGE 谱与抗生素敏感谱比较  55-56
    4.8.3 PFGE 电泳的影响因素  56-57
5. 结论  57-58
致谢  58-59
参考文献  59-65
攻读硕士学位期间发表的学术论文  65

牛源大肠杆菌耐药性及耐药机制研究

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