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土壤活性颗粒表面酸性磷酸酶的固定机理与特性

作　者: 乔学琴
导　师: 黄巧云
学　校: 华中农业大学
专　业: 土壤学
关键词: 酸性磷酸酶土壤胶体粘土矿物吸附热力学荧光光谱圆二色谱米氏方程水解稳定性微量热
分类号: S154.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

本课题以我国两种代表性土壤胶体和主要土壤粘粒矿物为材料，选取在土壤有机磷分解中起催化作用的酸性磷酸酶，运用等温平衡吸附法、荧光光谱、圆二色谱和微量热等方法探讨了酶在土壤胶体和矿物表面的吸附机理、固定态酶的酶促动力学特性、稳定性以及热力学特性等，为深入阐明土壤固相表面酶的特征、活性，探讨土壤组分相互作用机制，利用固定态酶调节土壤肥力和进行污染环境修复提供科学依据。获得的主要结果有：1．酶在不同土壤胶体和矿物表面的吸附均是自发过程，ΔH_ads＞0，ΔS_ads＞0表明吸附是熵驱动的吸热熵增过程。据ΔG_ads的绝对值比较，去有机质胶体＞含有机质胶体，红壤＞棕壤，针铁矿＞高岭石＞蒙脱石，意味着酶在去有机质和红壤胶体表面有更强的吸附趋势。酶在含有机质土壤胶体表面受到的静电排斥和疏水作用更为强烈，吸收的热量更多。2．游离酶以及从红壤、含有机质棕壤胶体、针铁矿、高岭石（pH 7.0）表面解吸的酶在336 nm处荧光发射最强，而从去有机质棕壤胶体、蒙脱石以及高岭石（pH 5.5）表面解吸的酶荧光发射峰位则发生了3 nm蓝移。解吸态酶荧光强度和峰位的变化意味着酶分子内部生色基团色氨酸和酪氨酸残基所处微环境极性发生了改变。3．吸附／解吸过程导致磷酸酶分子由无规卷曲向有序结构转化，α-螺旋和β-折叠结构含量增加。酶在含有机质棕壤胶体表面较去有机质棕壤胶体表面保留了更高的有序结构，而在红壤胶体中则以去有机质胶体表面的有序结构略高。固定在蒙脱石和针铁矿表面的酶，无规卷曲更多地转化为α-螺旋。与高岭石作用后的磷酸酶，在pH 5.5时β-转角和无规卷曲减少而β-折叠增加，在pH 7.0时β-结构均略有增加。4．固定改变了酶与底物的亲和力，高岭石—酶复合体与底物的亲和力较游离酶和其它固定态酶的高（K_m值最小）。固定态酶的V_max小于游离酶，且红壤胶体＞棕壤胶体，含有机质棕壤胶体＞去有机质棕壤胶体，而对红壤，则是去有机质胶体＞含有机质胶体。微量热测定显示游离酶催化反应放热的热量最多为-13.8 Jg^-1。固定态酶的放热量，红壤体系(-10.3～-11.0 J g^-1)＞棕壤体系(-6.8～-9.9 J g^-1)，去有机质体系(-9.9～-11.0 J g^-1)＞含有机质体系(-6.8～-10.3 J g^-1)。针铁矿体系中酶的V_max值为13.68μmol mg^-1 min^-1，放热量为-13.6 J g^-1，分别大于蒙脱石和高岭石体系中酶的V_max值(0.96～9.52μmol mg^-1 min^-1)和放热量(-4.9～-12.7 J g^-1)。5．固定在含有机质棕壤胶体表面的磷酸酶较去有机质棕壤胶体表面的酶更抗蛋白酶K的水解，而对红壤胶体体系而言，则是去有机质胶体表面的酶更抗水解作用。有机质和铁氧化物的存在对酶活性的保留具有促进作用。针铁矿固定的酶稳定性最强，蒙脱石次之，高岭石固定的酶稳定性最弱，体系pH7.0时其对水解作用更为敏感。6．首次运用微量热技术测定了不同矿物表面固定态酸性磷酸酶被蛋白酶K水解的热效应，与酶稳定性的测定结果一致：酶被胶体矿物固定后抗水解能力增强，并且以针铁矿表面的酶抗性最强（-267.5μJ），蒙脱石表面的酶其次（-338.9μJ），而高岭石表面的酶分子对水解作用较为敏感（-430.1μJ）。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
1 前言  10-21
  1.1 酶在矿物表面吸附固定的有关机理  10-13
    1.1.1 阳离子交换  10-11
    1.1.2 库仑力  11
    1.1.3 疏水力和范德华引力  11-12
    1.1.4 专性吸附作用  12-13
  1.2 胶体矿物对酶活性及稳定性的影响  13-14
  1.3 胶体矿物对酶促动力学特性的影响  14-16
  1.4 仪器分析技术在蛋白质研究中的应用  16-21
    1.4.1 荧光光谱  16-17
    1.4.2 圆二色谱  17-18
    1.4.3 微量热技术  18-21
2 材料与方法  21-25
  2.1 酶试剂  21
  2.2 土壤胶体和粘粒矿物的制备  21
  2.3 供试土壤胶体和粘粒矿物的基本性质测定  21
  2.4 酸性磷酸酶在土壤胶体和矿物表面吸附热力学测定  21-22
  2.5 游离态和解吸态酶荧光发射光谱分析  22
  2.6 游离态和解吸态酶圆二色谱的测定  22-23
  2.7 固定态酸性磷酸酶活性分析  23-24
    2.7.1 土壤胶体-酶复合体的制备  23
    2.7.2 酶促动力学  23
    2.7.3 游离和固定态磷酸酶水解稳定性的测定  23-24
  2.8 等温滴定量热法(ITC)测定固定态酶活性和稳定性  24-25
    2.8.1 实验原理  24
    2.8.2 酶活性测定  24
    2.8.3 酶稳定性测定  24-25
3 结果与分析  25-51
  3.1 土壤胶体和粘粒矿物的基本性质  25-26
  3.2 酸性磷酸酶在土壤胶体和矿物表面吸附热力学分析  26-29
    3.2.1 吸附等温线  26-27
    3.2.2 吸附热力学参数  27-29
  3.3 游离态和解吸态磷酸酶荧光发射光谱分析  29-32
  3.4 游离和解吸态磷酸酶的圆二色谱  32-37
  3.5 游离和固定态酶酶促动力学特性  37-40
  3.6 游离和固定态酸性磷酸酶的蛋白酶水解稳定性  40-44
  3.7 等温滴定量热法(ITC)测定固定态酶特性  44-51
    3.7.1 游离和固定态酶酶促热效应  44-48
    3.7.2 游离和固定态酶水解热效应  48-51
结论  51-52
参考文献  52-59
致谢  59

土壤活性颗粒表面酸性磷酸酶的固定机理与特性

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