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多杀菌素高产菌株的诱变育种

作　者: 徐晴雨
导　师: 林开春
学　校: 华中农业大学
专　业: 农药学
关键词: 多杀菌素育种原生质体制备融合
分类号: S482.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

通过对多杀菌素产生菌（Saccharopolyspora Spinosa）Co329菌株进行分离复壮，获得一株遗传性能较为稳定的菌株Co329-21，以Co329-21为出发菌株进行紫外线诱变育种，获得比出发菌株Co329-21效价（25μg／mL）提高9.7％的菌株UV125，对UV125进行NTG诱变，获得比UV125效价（27μg／mL）提高8.6％的菌株N263，以N263为出发菌株进行了⁶⁰Coγ7射线诱变，得到比N263效价（302μg／mL）提高21.5％的菌株Co305。以菌株Co305为出发菌株，进行原生质体紫外诱变，得到一株发酵效价提高18.7％的菌株PU446（43μg／mL），通过对PU446进行链霉素筛选获得一株发酵效价提高11.4％的菌株S119（485μg／mL）。通过以上育种多杀菌素菌种发酵效价提高了91.7％。以S119、PU131（试验室筛选，长势较好，发酵效价286μg／mL）为出发菌株，通过测定生长曲线，探索甘氨酸浓度和溶菌酶的酶解浓度、时间、温度对原生质体形成的影响，确定制备原生质体的最佳条件为：种子液中加入甘氨酸浓度0.4mg／mL、培养48小时，酶解浓度4mg／mL、酶解温度32℃、酶解时间90min。对4种再生培养基的比较，确定以改良高氏培养基为较优的再生培养基。通过原生质体灭活方式融合亲本S119、PUl31筛选得到一株分别比亲本菌株效价提高12.6％和90.9％的融合子R287菌株（54μg／mL）。传代试验表明菌株UV125、N263、C0325、PU446、S119和R287传代均比较稳定。另外，对菌株R287摇瓶发酵过程中的还原糖、总糖、铵离子及可溶性磷的测定，为多杀菌素工业发酵提供参考指标。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-9
1 前言  9-22
  1.1 生物农药  9
  1.2 多杀菌素的研究进展  9-20
    1.2.1 多杀菌素的产生菌  10
    1.2.2 多杀菌素的结构  10-12
    1.2.3 多杀菌素的理化性质  12-13
    1.2.4 多杀菌素的生物合成  13-15
      1.2.4.1 多杀菌素的生物合成基因  13-15
      1.2.4.2 聚酮链的生物合成途径  15
    1.2.5 多杀菌素的生物活性  15-17
    1.2.6 多杀菌素的构效关系  17-19
    1.2.7 多杀菌素的作用机理  19
    1.2.8 多杀菌素的剂型  19-20
  1.3 多杀菌素产生菌育种的研究  20-21
    1.3.1 常规诱变育种  20
    1.3.2 原生质体融合育种  20-21
  1.4 本试验研究的目的与意义  21-22
2 材料和方法  22-28
  2.1 试验材料  22-23
    2.1.1 培养基  22
      2.1.1.1 斜面培养基  22
      2.1.1.2 种子培养基  22
      2.1.1.3 发酵培养基  22
      2.1.1.4 高渗溶液(P培养液)  22
      2.1.1.5 原生质体再生培养基  22
    2.1.2 供试菌种  22
    2.1.3 主要试剂  22-23
    2.1.4 主要仪器  23
  2.2 试验方法  23-26
    2.2.1 培养条件  23
      2.2.1.1 斜面菌种培养条件  23
      2.2.1.2 种子培养条件  23
      2.2.1.3 发酵条件  23
      2.2.1.4 原生质体再生培养条件  23
    2.2.2 分析方法  23-24
      2.2.2.1 初筛(菌块—TLC法)  23
      2.2.2.2 复筛(HPLC法)  23-24
      2.2.2.3 菌丝量的测定  24
      2.2.2.4 种子液和发酵液中还原糖测定(DNS分光光度法)  24
      2.2.2.5 发酵液中总糖的测定  24
      2.2.2.6 发酵液中NH_4~+的测定(纳氏试剂分光光度法)  24
      2.2.2.7 发酵液中磷的测定(氯化亚锡分光光度法)  24
    2.2.3 诱变处理方法  24-25
      2.2.3.1 斜面菌种制备  24
      2.2.3.2 孢子悬液的制备  24
      2.2.3.3 发酵后处理  24-25
    2.2.4 高产菌株的选育及选育方法比较  25-26
      2.2.4.1 出发菌株的复壮  25
      2.2.4.2 预萌发孢子悬液的紫外诱变  25
      2.2.4.3 NTG诱变  25
      2.2.4.4 ~(60)Co-γ射线诱变处理  25
      2.2.4.5 原生质体紫外诱变处理  25
      2.2.4.6 链霉素诱变选育  25-26
        2.2.4.6.1 最小抑制浓度的确定  25-26
        2.2.4.6.2 链霉素诱变处理  26
  2.3 原生质体的制备与再生  26-28
    2.3.1 制备方法  26
    2.3.2 计数观察方法  26
    2.3.3 原生质膜的裂解  26
    2.3.4 原生质体再生培养基的选择  26-27
    2.3.5 原生质体的灭活  27
    2.3.6 原生质体融合  27-28
3 结果与分析  28-44
  3.1 出发菌株的选择  28
  3.2 预萌发孢子悬液的紫外诱变  28-29
    3.2.1 紫外线照射不同时间的诱变效果比较  28
    3.2.2 紫外诱变菌株的筛选  28-29
  3.3 菌株UV125的NTG诱变  29-30
    3.3.1 不同NTG浓度下的诱变效果比较  29
    3.3.2 NTG诱变菌株的复筛  29-30
  3.4 ~(60)Co-γ射线对菌株N263的诱变  30-31
    3.4.1 不同照射剂量下的诱变效果比较  30
    3.4.2 ~(60)Co-γ射线诱变菌株复筛  30-31
  3.5 原生质体紫外诱变菌株的筛选  31-32
    3.5.1 不同照射剂量下的诱变效果比较  31
    3.5.2 原生质体紫外诱变菌株的筛选  31-32
  3.6 菌株PU446的硫酸链霉素诱变  32-33
    3.6.1 最小抑制浓度曲线的确定  32
    3.6.2 链霉素诱变菌株的筛选  32-33
  3.7 原生质体技术  33-38
    3.7.1 原生质体制备  33-36
      3.7.1.1 多杀菌素产生菌的菌丝生长曲线  33-34
      3.7.1.2 甘氨酸对原生质体形成的影响  34
      3.7.1.3 酶解时间及温度对原生质体形成的影响  34-36
      3.7.1.4 原生质体再生培养基的选择结果  36
    3.7.2 原生质体融合  36-38
      3.7.2.1 热灭活与紫外灭活剂量的确定  36-37
      3.7.2.2 原生质体融合效果  37-38
        3.7.2.2.1 不同分子量及不同浓度PEG对原生质体融合的影响  37-38
        3.7.2.2.2 融合后再生菌落的筛选  38
  3.8 传代稳定性试验  38-40
  3.9 菌株R287的发酵参数测定  40-44
    3.9.1 葡萄糖溶液吸光度标准曲线的制定  40
    3.9.2 种子液代谢测定结果  40-41
    3.9.3 NH_4~+和可溶性磷吸光度标准曲线的制定  41-42
    3.9.4 发酵液代谢测定结果  42-44
4 讨论与分析  44-46
  4.1 菌株诱变  44
  4.2 抗性筛选对菌株产素水平的影响  44
  4.3 原生质体的制备及再生研究  44
  4.4 原生质体灭活的应用  44-45
  4.5 原生质体融合的研究  45-46
参考文献  46-51
致谢  51

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