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中介蝮蛇毒蛋白质组学研究

作　者: 曹璟
导　师: 杨章民
学　校: 陕西师范大学
专　业: 分子生物学
关键词: 中介蝮蛇毒双向电泳飞行时间质谱蛋白质组学
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

随着人类基因组计划（Human Genome Project）的完成，生命科学研究已进入后基因组时代，其标志之一就是蛋白质组学（Proteomics）的兴起。蛋白质作为基因功能的直接执行者，其在特定细胞、组织或器官中的表达模式如何日益引起科学家们的关注，蛋白质组学也一跃成为生命科学的热点。目前，蛋白质组学在揭示疾病的发病机理、寻找肿瘤标志物及研究药物的作用机制等方面已被广为采用。蛇毒（Snake venom）是从蛇毒腺中分泌的许多具有药理学活性的功能性酶及多肽的复杂混合物。它可以麻痹和杀死猎物，也是开发新型药物的宝贵资源。随着蛋白质组学的兴起，以及蛇毒在蛋白组成方面的相对简单性，蛋白质组学方法在蛇毒研究方面开始暂露头角。近年来，国内外已经相继有包括游蛇科（Colubridae）、蝰科[响尾蛇亚科（Cromlini）、蝮亚科（Agkistrodontini）]、眼镜蛇科（Elapidae）在内的近70种蛇毒的蛋白质组学研究报道。鉴定出了包括蛇毒金属蛋白酶（Snake venom metalloproteinases，SVMPs）、丝氨酸蛋白酶（serine proteases）、神经毒素（Neurotoxins）、心脏毒素（Cardiotoxins）、富含半胱氨酸的分泌蛋白（Cysteine-rich secretory proteins）、神经生长因子（Nerve growth factor，NGF）、L-氨基酸氧化酶（L-amino acid oxidase）、缓激肽增强肽（Bradykinin potentiating peptide，BPP）、肌肉毒素（Myotoxin）在内的许多有意义的蛋白。这些对蛇毒组分的方位研究结果对于蛇毒的进化、中毒治疗、抗血清生产及药物开发均具有重要意义。中介蝮（G．Intermedius）是广泛分布于我国西北地区及华北部分地区的一种毒蛇，也是我国6种蝮蛇中毒性最大的一种蝮蛇。目前，已有新疆、内蒙、青海该蛇为害的报道。以往关于中介蝮的形态、动物区系、食性及生态、毒液的生物化学与毒理学等方面已有研究报道。然而，至今仍缺乏对其蛇毒组分的整体研究，这不但妨碍其蛇伤的有效治疗，也是限制其开发利用的一个瓶颈。为此，本研究拟以采集自陕北的中介蝮蛇毒为材料，运用双向电泳（Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）及基质辅助激光解离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术对其蛇毒进行了蛋白质学研究。结果如下：1．粗毒中各组分的分子量在94 kDa以内，主要分布在约30 kDa-67 kDa、12kDa～14 kDa两个范围，提示在这两个分子量区间内的蛋白质含量丰富，高丰度表达。另外，在45.0 kDa～66.2 kDa区间有中等表达水平的蛋白分布。2．粗毒经基质辅助激光解离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术测定，发现粗毒中低分子量的组分16个，分子量分布在1kDa～15kDa之间。3．经2-DE联合MALDI-TOF MS方法分析，结合双向电泳蛋白质点的表观分子量及等电点，运用生物信息学方法，搜索到22个匹配的蛋白质点信息，初步鉴定得到了22种蛋白质。这些蛋白质主要归属于Ⅲ型金属蛋白酶家族、丝氨酸蛋白酶家族、磷脂酶A₂族成员，此外还有L-氨基酸氧化酶家族成员、CRISP家族成员、以及少数神经生长因子。这些蛋白质的等电点（pI）分布在5.2～8.3之间，分子量分布在14kDa～60kDa之间。酸性蛋白质最多，中性蛋白质次之，碱性蛋白质最少。4．另外，6个蛋白质点没有获得肽质量指纹（Peptide mass fingerprinting，PMF）图谱，或者信号质量太差，在数据库中得不到可靠匹配，因此无法进行鉴别。以上结果表明，中介蝮蛇毒组分中，主要毒素的分子量分布在14 kDa-67 kDa之间。2-DE联合MALDI-TOFMS分析，共鉴别出22种蛋白，归属于6个家族，分别为：Ⅲ型金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、磷脂酶A₂、L-氨基酸氧化酶、CRISP及神经生长因子。其等电点（pI）分布在5.2～8.3之间，分子量分布在14 kDa～60 kDa之间。其中，酸性蛋白质最多，中性蛋白质次之，碱性蛋白质最少。有6种蛋白因未能获得肽质量指纹或者肽指纹质量太差无法进行鉴别。看来，要想获得完美的蛋白质组学结果，还要与其它质谱方法进行结合，并与来自其它系统性研究的资料（如cDNA文库）印证。另外，所鉴别蛋白的功能如何，还有待进一步的研究与表征。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
第一部分文献综述  10-31
  1.1 世界的毒蛇与分类  10
  1.2 亚洲蝮的分类与分布  10
  1.3 蛇毒研究进展  10-18
    1.3.1 金属蛋白酶家族  11-12
    1.3.2 丝氨酸蛋白酶家族  12-13
    1.3.3 神经毒素  13-14
    1.3.4 L-氨基酸氧化酶  14-15
    1.3.5 缓激肽增强肽家族  15-16
    1.3.6 富含半胱氨酸的分泌蛋白家族  16
    1.3.7 神经生长因子  16-17
    1.3.8 肌肉毒素  17-18
    1.3.9 其它毒素  18
  1.4 蛇毒的研究现状  18-20
  1.5 蛋白质组学进展  20-30
    1.5.1 蛋白质组学简介  20
    1.5.2 蛋白质组学研究在生命科学中的应用  20-22
    1.5.3 蛇毒蛋白质组学研究进展  22-30
      1.5.3.1 质谱前的分离  23-24
      1.5.3.2 蛇毒蛋白的质谱鉴定  24-26
      1.5.3.3 生物信息学查询  26-27
      1.5.3.4 蛇毒蛋白质组学研究现状  27-30
  1.6 选题依据  30-31
第二部分中介蝮蛇毒蛋白质组学研究  31-39
  2.1 实验材料  31
    2.1.1 实验试剂  31
    2.1.2 实验仪器  31
  2.2 实验方法  31-34
    2.2.1 不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳  31-32
    2.2.2 粗毒分子量的质谱测定  32
    2.2.3 固相pH梯度双向凝胶电泳  32-33
    2.2.4 凝胶图像分析  33-34
    2.2.5 银染蛋白质点的肽质量指纹图分析  34
    2.2.6 数据库查询  34
  2.3 实验结果  34-39
    2.3.1 中介蝮蛇毒不连续SDS-PAGE电泳结果  35
    2.3.2 粗毒分子量的质谱测定结果  35-36
    2.3.3 中介蝮蛇毒双向电泳分离结果  36
    2.3.4 MALDI-TOF-MS分析蛋白质点  36-37
    2.3.5 PMF的数据库查询及蛋白质点的鉴定  37-39
第三部分.分析与讨论  39-47
  3.1 Ⅲ型蛇毒金属蛋白酶  39-41
  3.2 蛇毒丝氨酸蛋白酶  41-43
  3.3 磷脂酶A_2  43-44
  3.4 L-氨基酸氧化酶  44-45
  3.5 富含半胱氨酸分泌蛋白  45-46
  3.6 神经生长因子  46-47
第四部分.问题与展望  47-49
结论  49-50
参考文献  50-63
缩略词表  63-64
附图Ⅰ  64-65
附图Ⅱ  65-72
致谢  72-73
攻读学位期间研究成果  73

中介蝮蛇毒蛋白质组学研究

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