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目的:在人类基因组中,有98%的DNA序列属于非编码序列。非编码序列中大约有一半的序列属于重复序列,主要的重复序列类型有长散在核元件(long interspersed nuclear elements,LINEs)、短散在核元件(short interspersed nuclear elements,SINEs)和长末段重复序列(long terminal repeat,LTR)等,其中的LINEs包括LINE1(L1)和LINE2(L2),SINEs主要包括Alu家族(Alu family)。L1重复序列和Alu分别占据了人类基因组的16.9%和9.9%,两者是人类基因组中最主要的重复序列。L1序列中蕴藏着重要的遗传和分化信息,在容易失活的基因、等位排斥基因及其侧翼存在较多的L1序列,比如免疫细胞的B细胞受体基因,T细胞受体基因,细胞因子中的白介素2基因等。另外L1与基因表达调节,肿瘤发生,个体发育,生物进化等有关。Alu家族是一组广泛分布的,300bp大小的重复序列,在人类单倍体基因组中约有100万个Alu(包括不完整的重复序列),是含量次多的重复序列。Alu与多种生物学现象有关,包括肿瘤发生,染色体重组,翻译调节。研究表明,Alu与免疫系统也具有密切相关性。Alu序列可能被一些正向的顺式调节元件所识别,比如人类的CD8α基因T细胞特异性的增强子。Hambor等研究证实CD8α基因中最后一个内含子中的Alu插入片段起到增强子作用。已知L1有10个家族(L1M4, L1M3, L1M2, L1M1, L1P5,L1P4,L1P3,L1P2,L1P1和Hs)。根据其开放阅读框(2opened reading frame2, ORF2)和3’非翻译区同源性进行分类,这10个家族又可以分为75种亚类(亚家族),Han等发现将L1ORF2(来自于L1家族中的L1.2亚家族)插入报告基因下游可以下调EGFP(Enhanced green fluorescent protein,增强性绿色荧光蛋白,简称GFP)表达,那么其他家族成员是否也有类似表现还尚且不明,而且GFP基因为何会受到下游插入L1.2序列的影响目前也仍属未知。本文中我们将来自另外一个亚家族成员L1PA3的ORF2按不同方向以及14个Alu重复序列串联装入pEGFP-C1质粒中(分别简称p-ORF2,p-ORF2as,p-Alu14),瞬时转染HeLa细胞,镜下观察GFP荧光阳性细胞的比例,以研究不同种类的重复序列对GFP报告基因表达的影响。考虑到其抑制作用可能存在多种机制,为了更好的了解非编码重复序列对基因表达调节的分子作用机理,我们在构建好的质粒基础上插入猴巨细胞病毒早期蛋白多聚腺苷酸加尾信号(simian virus40 polyadenylation signal,SV40PolyA,简称PolyA)正、反序列(240bp)以观察PolyA及PolyAas对p-ORF2、p-ORF2as、p-Alu14中GFP荧光报告基因的影响。方法:1构建p-ORF2,p-ORF2as,p-Alu14重组质粒PCR扩增RP11克隆上L1PA3的ORF2,在引物设计合适的限制性核酸内切酶切位点。经酶切后将PCR扩增产物ORF2、ORF2as分别装入pEGFP-C1质粒GFP下游MCS(p-ORF2,p-ORF2as)。PCR扩增RP11克隆上的Alu,在引物设计合适的酶切位点,根据XbaⅠ和NheⅠ酶切位点可以连接不能切断的特性,反复串联构建出含有14个Alu的表达载体(p-Alu14)。2构建插入polyA正、反序列的重组质粒PCR扩增pEGFP-C1质粒的PolyA,在上、下游引物设计合适的酶切位点,在p-ORF2,p-ORF2as,p-Alu14质粒中的GFP基因下游按正、反方向插入PolyA,分别命名为p-A-ORF2, p-A-ORF2as, p-A-Alu14 , p-Aas-ORF2 , p-Aas-ORF2as ,p-Aas-Alu14。3细胞转染和荧光观察将构建好的质粒用LipofectamineTM2000瞬时转染HeLa细胞,以转染空载体pEGFP-C1和未转染的HeLa细胞做为对照,荧光显微镜下计数观察GFP荧光阳性细胞数,白光下计数同样视野的细胞总数(每个样本至少500个),计算荧光阳性细胞百分率。在白光和荧光下分别对同一视野照相。结果:1插入序列均不同程度抑制GFP荧光将p-ORF2,p-ORF2as, p-Alu14三个质粒瞬时转染HeLa细胞,24小时后观察荧光细胞阳性率。通过荧光计数观察发现,p-ORF2(0.47±0.10)%,p-ORF2as(3.72±0.58)%,p-Alu14(0.03±0.05)%三者荧光表达率均明显低于pEGFP-C1质粒荧光表达率(35.93±1.81)%。在GFP下游插入不同序列对荧光抑制程度不同:Alu14抑制作用最强,ORF2次之,ORF2as最弱。未转染的HeLa无荧光表达。2 PolyA正、反序均可以上调受抑制的GFP基因当p-ORF2,p-ORF2as,p-Alu14三个质粒的GFP下游插入正序PolyA后瞬时转染HeLa细胞24h后观察荧光细胞,计数并计算荧光细胞百分数。三种质粒荧光表达率分别为:p-A-ORF2(7.69±0.55)% , p-A-ORF2as(11.2±1.14)% ,p-A-Alu14(3.94±0.26)%。均高于对应的未插入PolyA的p-ORF2,p-ORF2as,p-Alu14。当p-ORF2,p-ORF2as,p-Alu14三个质粒的GFP下游插入反序PolyA后瞬时转染HeLa细胞24h后观察荧光细胞,计数并计算荧光细胞百分数。三种质粒荧光表达率分别为:p-Aas-ORF2(9.15±0.77)% , p-Aas-ORF2as(15.24±0.88)% , p-Aas-Alu14(5.67±0.59)%。均高于对应的未插入PolyAas的p-ORF2,p-ORF2as,p-Alu14。结论:1在GFP基因下游插入长度相同的L1ORF2,ORF2as,Alu14后,与pEGFP-C1相比较,三者均下调GFP的表达。2 ORF2,ORF2as和Alu14下调GFP表达的水平不同,插入Alu14的质粒荧光蛋白表达最低,ORF2次之,两者下调能力均强于ORF2as。3 p-ORF2,p-ORF2as,p-Alu14质粒中GFP基因下游分别按正、反方向插入SV40早期mRNA的PolyA序列,均可以显著地上调GFP基因的表达,说明PolyA解除GFP基因抑制与PolyA方向无关。
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