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细菌群体感应信号分子降解基因aiiA的功能研究

作　者: 戴岳
导　师: 陈士云
学　校: 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）
专　业: 微生物学
关键词: aiiA基因群体感应生物膜耐药性植物抗病
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

群体感应(Quorum sensing，QS)是一种细菌细胞通讯机制，即细菌通过合成、分泌称为自诱导物(autoinducer，AI)的信号分子，当AI浓度随着细菌不断生长、群体密度达到一定阈值时，启动特定基因的表达。N—乙酰高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)是革兰氏阴性细菌群体感应系统的信号分子。来源于一些细菌的aiiA(acyl-homoserine lactonase)基因编码AHLs水解酶，通过水解AHLs的内酯键，产生脂酰高丝氨酸，使AHLs信号分子失活，降低了AHLs分子的浓度从而干扰群体感应系统。本论文将来源于苏云金芽胞杆菌的群体感应信号分子降解基因aiiA分别在铜绿假单胞菌和烟草表达，对其功能进行了研究，获得了以下结果：将aiiA基因在铜绿假单胞菌标准株PAO1和两种临床耐药菌株中表达，检测了弹性蛋白酶和绿脓菌素等重要的毒力因子，发现表达aiiA基因的菌株中毒力因子的含量明显少于野生型对照和空载体对照；与运动性相关的群游运动(swarming motility)测定也表明，aiiA基因的表达影响了细菌的群游运动。进一步通过液体和固体表面形成细菌生物膜(biofilm)的差异进行比较以及对生物膜的结构进行扫描电镜观察，结果表明aiiA基因的表达对铜绿假单胞菌生物膜的形成和分散有重要影响，同时通过药敏实验发现aiiA基因的表达还能明显降低铜绿假单胞菌的耐药现象，增强对广谱抗生素的敏感性。这些研究结果表明aiiA基因的表达不仅能够降低毒力因子的表达，影响生物膜的形成，还能够达到降低细菌耐药性的效果。将aiiA基因构建到植物表达载体转化烟草，接种植物病原细菌胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)和真菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，发现转化烟草抗病效果均显著增强，表现出广谱的抗病现象。其中，AiiA蛋白能通过降解胡萝卜软腐欧文氏菌QS系统中的AHLs信号分子，增强植物对胡萝卜软腐欧文氏菌的抗性。此外，通过对核盘菌侵染关键作用因子草酸含量的HPLC测定，发现转化烟草表达的AiiA蛋白可能通过降解草酸减弱核盘菌对植物的侵染。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-8
第一章文献综述  8-18
  1 细菌的群体感应系统  8-11
  2 铜绿假单胞菌的群体感应系统  11-12
  3 群体感应系统对铜绿假单胞菌的调控  12-14
    3.1 群体感应系统调控毒力因子表达  13
    3.2 群体感应系统调控生物膜形成  13-14
    3.3 群体感应系统与细菌耐药性的关系  14
  4 群体感应系统的干扰  14-17
    4.1 AHLs分子的灭活  14-16
    4.2 抑制AHLs分子与受体蛋白结合  16
    4.3 抑制AHLs分子的产生  16-17
  5 细菌群体感应调控研究的意义  17-18
第二章群体感应信号分子降解基因对铜绿假单胞菌生物膜及耐药性的影响  18-37
  1 材料与方法  19-23
    1.1 材料  19-23
      1.1.1.菌株与质粒  19
      1.1.2.培养基  19-20
      1.1.3.试剂  20
      1.1.4.引物设计和PCR扩增  20
      1.1.5.表达载体的构建和转化  20-21
      1.1.6.融合蛋白的诱导表达  21
      1.1.7.目的蛋白的SDS-PAGE检测  21
      1.1.8.抗体的制备  21
      1.1.9.Western blot检测目的蛋白的表达  21-22
      1.1.10.生长曲线测定  22
      1.1.11.弹性蛋白酶活性测定  22
      1.1.12.绿脓菌素含量测定  22
      1.1.13.群游运动的检测  22
      1.1.14.生物膜模型的建立及生物量测定  22-23
      1.1.15.扫描电镜观察  23
      1.1.16.药敏实验  23
  2 结果与分析  23-34
    2.1.allA基因的克隆及鉴定  23
    2.2.allA的表达及SDS-PAGE分析  23-24
    2.3.allA抗体的制备  24-26
    2.4.AtIA的WESTERN BLOT分析  26
    2.5.生长曲线测定  26-27
    2.6.毒力因子的检测  27-28
      2.6.1 弹性蛋白酶活性  27
      2.6.2 绿脓菌素含量  27-28
    2.7.对群游运动的影响  28-29
    2.8.对PAO1生物膜形成的影响  29-30
    2.9.对PAO1耐药性的影响  30-32
    2.10 对临床耐药菌株生物膜和耐药性的测定  32-34
    2.11 铜绿假单胞菌QS系统缺陷株的耐药性分析  34
  3 讨论  34-37
第三章 allA基因转化烟草对抗病的影响  37-48
  1 材料和方法  38-41
    1.1 材料  38-39
    1.2 方法  39-41
      1.2.1 植物表达载体的构建  39
      1.2.2 植物表达载体导入根癌农杆菌EHA105菌株  39-40
        1.2.2.1 农杆菌EHA105菌株感受态细胞的制备  39
        1.2.2.2 感受态细胞的转化  39-40
        1.2.2.3 农杆菌质粒的提取与鉴定  40
      1.2.3 烟草的转化  40
      1.2.4 转化烟草的鉴定  40-41
      1.2.5 病原物接种  41
      1.2.6 草酸含量的分析  41
  2 结果  41-45
    2.1 转基因植物的PCR检测  41-42
    2.2 转化烟草的广谱抗病性  42-44
      2.2.1 转allA基因植物对细菌性病原物的抗性  42-43
      2.2.2 allA转基因植物对真菌性病原物的抗性  43-44
    2.3 草酸含量测定  44-45
  3 讨论  45-48
参考文献  48-53
发表及待发表文章目录  53-54
致谢  54

细菌群体感应信号分子降解基因aiiA的功能研究

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