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鹅血中转铁蛋白的分离提取及其性质研究

作　者: 冯敏杰
导　师: 周惠明
学　校: 江南大学
专　业: 粮食、油脂及植物蛋白工程
关键词: 鹅血清转铁蛋白铁结合能力抑菌性能
分类号: TQ936
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

鹅血是宝贵的动物蛋白资源，其中的转铁蛋白、免疫球蛋白等都是具有生物活性功能的蛋白。然而，目前对鹅血资源的利用非常有限。本文以开发利用废弃的鹅血资源为出发点，从鹅血中分离制备得到主要的功能性蛋白，并对其理化性质和生物学功能进行了深入的研究。鹅血经冷冻离心，使其中的血清和血红蛋白得到分离，并冷冻干燥鹅血清，低温保藏。采用醋酸纤维膜电泳和凝胶层析分析了鹅血清中清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白的含量。经醋酸纤维膜测定结果表明，鹅血中β球蛋白含量较高为34.89mg／dL，而γ-球蛋白的含量较少。采用离子交换和凝胶过滤分离手段，从鹅血清中分离纯化出转铁蛋白。经HPLC对转铁蛋白的纯度鉴定检验，结果表明鹅转铁蛋白的纯度达到98％以上。用SDS-PAGE测得鹅转铁蛋白的分子量为77，820。观察不同pH值条件下蛋白质的溶解情况，测得转铁蛋白的等电点约为5.6左右。EDTA-乙酸盐缓冲液对转铁蛋白脱铁，所制得的脱铁转铁蛋白为白色絮状固体，易溶于水。用DSC测得鹅转铁蛋白的变性温度为60℃至90℃。用紫外分光光度法测得2％（w／w）铁饱和转铁蛋白在465nm处的吸收值为0.5。pH、NaHCO₃和温度对转铁蛋白结合铁的能力都有影响。在中性和偏碱性的条件下，转铁蛋白的铁结合能力比较高。当pH为7.8时，铁结合能力最强。当pH低于6.5时，结合铁能力显著下降。NaHCO₃浓度的增加有利于铁结合能力的增强，但当其浓度超过100mmol／L以后，这种作用就不明显了。在70℃以下的热处理后，转铁蛋白的铁结合能力略有下降，但下降幅度不大（3％以内）。而70℃以上的热处理对转铁蛋白的铁结合能力有比较大的影响。因此采用温度不超过70℃的较低杀菌强度有助于保持转铁蛋白的铁结合性能。运用CD（圆二色性光谱）、紫外可见光和荧光光谱，研究转铁蛋白结合Fe³⁺，对其结构的影响，以及铝离子对不同形式的转铁蛋白的影响。实验结果表明每个鹅转铁蛋白能结合两个铝离子，但是铝离子不能取代含铁转铁蛋白中的铁离子。研究了铁饱和度、pH、温度和阳离子对转铁蛋白抑菌性能的影响。转铁蛋白对革兰氏阴性菌的抑制能力要强于对革兰氏阳性菌的抑制。随着铁饱和度的增加，转铁蛋白的抑菌能力随之减弱。可能是由于转铁蛋白结合铁离子后，改变了结构，从而影响了转铁蛋白抑菌能力。pH为7时转铁蛋白的抑菌效果最佳。pH在5～9的范围内变化对转铁蛋白抑制革兰氏阴性菌影响不大，但对转铁蛋白抑制革兰氏阳性菌影响较大。pH小于5.0或者大于9.0时，转铁蛋白的抑菌性能受到很大的影响。65℃～70℃热处理对转铁蛋白抑菌能力没有太大的影响。阳离子(Na⁺、Ca²⁺)浓度的增加，将影响转铁蛋白的抑菌性能。

全文目录

目录  3-6
中文摘要  6-7
英文摘要  7-9
第一章绪论  9-16
  1.1 动物血的功能性质及利用现状  9-11
  1.2 转铁蛋白家族的结构和生物活性功能  11-12
    1.2.1 转铁蛋白的结构及理化性质  11-12
    1.2.2 转铁蛋白的生物活性功能  12
  1.3 转铁蛋白的研究进展  12-14
  1.4 转铁蛋白应用与开发前景  14
  1.5 立题背景和意义  14-15
  1.6 主要研究内容  15-16
第二章鹅血清中球蛋白成分的分析  16-22
  2.1 引言  16
  2.2 材料与设备  16-17
    2.2.1 实验试剂与材料  16
    2.2.2 主要设备  16-17
  2.3 实验方法  17-18
    2.3.1 鹅血清的分离及其保藏  17
    2.3.2 鹅血清中蛋白的含量  17
    2.3.3 鹅血清醋酸纤维膜电泳  17
    2.3.4 鹅血清中γ球蛋白的分析  17-18
      2.3.4.1 血清Ig的粗提  17-18
      2.3.4.2 血清Ig的纯化  18
      2.3.4.3 各峰对应蛋白抑菌性能的研究  18
  2.4 结果与讨论  18-21
    2.4.1 鹅血清的分离及其保藏  18
    2.4.2 鹅血清中蛋白的含量  18
    2.4.3 鹅血清醋酸纤维膜电泳  18-20
    2.4.4 鹅血清中γ球蛋白的分析  20-21
  2.5 本章小结  21-22
第三章鹅血清中转铁蛋白的分离纯化及其性质研究  22-34
  3.1 引言  22
  3.2 材料与设备  22-23
    3.2.1 实验材料  22
    3.2.2 实验设备  22-23
  3.3 实验方法  23-25
    3.3.1 鹅血清中转铁蛋白的分离纯化  23
      3.3.1.1 转铁蛋白的初步分离  23
      3.3.1.2 转铁蛋白的纯化  23
    3.3.2 转铁蛋白纯度的测定  23
    3.3.3 转铁蛋白的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳  23-25
    3.3.4 脱铁转铁蛋白的制备  25
    3.3.5 自制含铁和脱铁转铁蛋白含铁量的测定  25
    3.3.6 含铁量对转铁蛋白变性温度的影响  25
    3.3.7 铁离子对转铁蛋白结构的影响  25
    3.3.8 转铁蛋白氨基酸分析  25
    3.3.9 转铁蛋白的等电点(pI)的测定  25
  3.4 结果与讨论  25-33
    3.4.1 鹅血清中转铁蛋白的分离纯化  25-27
    3.4.2 转铁蛋白纯度的测定  27
    3.4.3 转铁蛋白的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳  27-28
    3.4.4 脱铁转铁蛋白的制备  28
    3.4.5 自制含铁和脱铁转铁蛋白含铁量的测定  28-30
    3.4.6 含铁量对转铁蛋白变性温度的影响  30-31
    3.4.7 转铁蛋白氨基酸分析  31-32
    3.4.8 转铁蛋白的等电点(pI)的测定  32-33
  3.5 本章小结  33-34
第四章转铁蛋白结合铁及铝对其影响的研究  34-44
  4.1 引言  34
  4.2 材料和设备  34-35
    4.2.1 实验材料  34
    4.2.2 主要设备  34-35
  4.3 实验方法  35
    4.3.1 完全饱和铁TF的制备  35
      4.3.1.1 完全饱和铁TF A_(465)的测定  35
    4.3.2 脱铁转铁蛋白的制备  35
      4.3.2.1 脱铁转铁蛋白结合铁活性的测定  35
    4.3.3 环境因素对TF结合铁能力的影响  35
      4.3.3.1 pH对铁结合能力的影响  35
      4.3.3.2 NaHCO_3对铁结合能力的影响  35
      4.3.3.3 热处理对铁结合能力的影响  35
    4.3.4 铝离子对含铁和不含铁TF影响的研究  35
  4.4 结果与讨论  35-43
    4.4.1 自制转铁蛋白样品的铁结合能力与铁饱和度  35-36
    4.4.2 环境对转铁蛋白结合铁能力的影响  36-38
      4.4.2.1 NaHCO_3浓度对铁结合能力的影响  36-37
      4.4.2.2 热处理对铁结合能力的影响  37-38
      4.4.2.3 pH对铁结合能力的影响  38
    4.4.3 铝离子对含铁和不含铁TF影响的研究  38-43
      4.4.3.1 UV可见光谱  38-39
      4.4.3.2 荧光光谱  39-41
      4.4.3.3 圆二色谱  41-43
  4.5 本章小结  43-44
第五章鹅转铁蛋白对常见致病菌的抑制作用  44-51
  5.1 前言  44
  5.2 材料与设备  44
    5.2.1 实验材料  44
    5.2.2 主要设备  44
  5.3 实验方法  44-45
    5.3.1 不同铁饱和度转铁蛋白的制备  44
    5.3.2 自制不同铁饱和转铁蛋白的铁饱和度测定  44
    5.3.3 抑菌性能的测定  44-45
    5.3.4 不同铁饱和转铁蛋白的铁饱和度的测定  45
    5.3.5 环境因素对转铁蛋白抑菌性能的影响  45
      5.3.5.1 pH对抑菌性能的影响  45
      5.3.5.2 热处理对抑菌性能的影响  45
      5.3.5.3 阳离子对抑菌性能的影响  45
  5.4 结果与讨论  45-49
    5.4.1 自制不同铁饱和转铁蛋白的铁饱和度的测定  45-46
    5.4.2 转铁蛋白对不同微生物的抑菌性能  46-48
    5.4.3 铁饱和度对抑菌性能的影响  48
    5.4.4 影响转铁蛋白抑菌性能的环境因素  48-49
      5.4.4.1 pH对抑菌性能的影响  48
      5.4.4.2 热处理程度对抑菌性能的影响  48-49
      5.4.4.3 阳离子的影响  49
  5.5 本章小结  49-51
主要结论  51-52
致谢  52-53
参考文献  53-56
攻读硕士学位期间发表的文章  56

鹅血中转铁蛋白的分离提取及其性质研究

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