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花椰菜叶色性状连锁的RAPD标记的研究

作　者: 李梅
导　师: 申书兴；孙德岭
学　校: 河北农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 花椰菜叶色突变体 RAPD
分类号: S635.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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引　用: 4次
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内容摘要

叶色突变体在育种上具有重要的应用价值，一方面通过基因突变可以创造出优异的种质资源，增加物种的遗传多样性，进而选育出优良的蔬菜新品种和新类型；另一方面叶色突变体作为标记性状在杂种一代制种工作中有着特殊的意义和作用，它可准确辨别亲本和杂一代的杂株，大大提高杂种纯度和质量。本研究以花椰菜正常植株灰绿色叶片（代号为02YUN-24-1）和同一自交系中的突变株绿色叶片（代号为02YUN-24-2）为试验材料，研究结果如下： 1、通过比较6个因素的RAPD扩增结果，建立了一套稳定性高、重复性强的花椰菜RAPD标记反应体系和技术体系。由于RAPD对反应体系要求比较严格，扩增反应中各种成分的变化都可能影响扩增结果。实验中我们对影响RAPD反应结果的主要因素：模板、引物、dNTP、Mg²⁺、Taq DNA聚合酶、退火温度等进行梯度设置，观察随机扩增结果，得到最佳的反应体系和条件。采用这种方法，能够扩增出多态性丰富、带型清晰稳定的图谱，为进一步开展花椰菜分子标记工作提供了技术支撑。 2、利用优化好的花椰菜RAPD反应体系，采用122个10bp的随机引物，检测了正常株和突变株基因组DNA间的多态性。在检测的969个位点中，只有一个位点表现出差异，该差异标记为正常株基因组所特有，片段大小为1567bp。 3、通过将S140／1567标记进行单株个体检测，发现灰绿色叶片正常株都具有此特异带，表明为灰绿色叶片正常株所特有。并将此特异片段进行了测序，序列分析结果表明，S140差异性片段与拟南芥5号染色体上的P1克隆-MCK75以及拟南芥5号染色体上的TAC克隆-K21L19上的序列同源，同源性均为84％。通过NCBI中的BLASTx将此特异片段翻译成氨基酸序列，结果显示与拟南芥蛋白质家族中的Glycerophosphoryl diester phosphodiesterase family protein高度同源，同源性为84％，为进一步研究花椰菜叶色基因的调控和叶色相关基因克隆打下基础。 4、本试验所用材料为绿色叶片突变体，在花椰菜中极为罕见；通过对花椰菜正常株和突变株不同叶位净光合速率的比较研究表明，两者净光合速率变化无显著差异，说明花椰菜叶色突变体对光合作用和碳水化合物的合成无明显的影响。为进一步评价绿色叶片突变体在育种中的应用价值，我们以花椰菜灰绿色叶片正常植株为对照调查了其主要经济性状，其结果二者之间基本相同，这表明绿色叶片突变体未连锁不良农艺性状，是非常珍贵的花椰菜育种种质资源。 5、在所查阅到的国内外文献中，未见花椰菜叶色突变体及相关研究的报道。本研究的创新在于： ①建立和完善了适合花椰菜的RAPD反应的技术体系； ②首次得到了与花椰菜灰绿色叶色性状相连锁的RAPD标记，为进一步研究花椰菜叶色基因的调控和叶色相关基因克隆打下基础。

全文目录

1 引言  8-13
  1.1 RAPD分子标记技术的原理  8-9
  1.2 RAPD分子标记技术在芸薹属植物育种中的应用  9-10
    1.2.1 核心种质资源的保存  9
    1.2.2 遗传多样性和物种亲缘关系  9
    1.2.3 遗传图谱的构建  9-10
    1.2.4 品种(杂种)纯度鉴定  10
    1.2.5 分子标记辅助选择  10
    1.2.6 其它应用研究  10
  1.3 花椰菜RAPD分子标记的研究现状  10-11
  1.4 国内外芸薹属叶色突变体的研究现状与进展  11-12
  1.5 本研究的目的与意义  12-13
2 材料与方法  13-17
  2.1 试验材料  13-14
    2.1.1 材料的获得  13
    2.1.2 仪器  13
    2.1.3 试剂  13
    2.1.4 试验中用到的部分试剂的配制  13-14
  2.2 试验方法  14-17
    2.2.1 花椰菜基因组DNA的提取及纯化  14-15
    2.2.2 基因组DNA的检测  15
    2.2.3 随机扩增多态性DNA技术反应条件的优选  15-16
    2.2.4 随机扩增多态性DNA技术的反应体系及反应程序  16
    2.2.5 引物的筛选  16
    2.2.6 随机扩增多态性DNA标记的确定  16
    2.2.7 花椰菜主要经济性状的调查和净光合速率的测定  16-17
3 结果与分析  17-29
  3.1 花椰菜基因组DNA的提取  17
  3.2 花椰菜基因组DNA紫外吸收状况  17-18
  3.3 花椰菜RAPD反应条件的优化  18-21
    3.3.1 花椰菜RAPD反应体系的建立  18-21
    3.3.2 热循环状态的确定  21
  3.4 花椰菜叶色基因连锁的RAPD标记片段的获得  21-23
    3.4.1 花椰菜叶色正常株与突变株RAPD扩增表现出很高的同源性  21
    3.4.2 花椰菜叶色正常株与突变株之间RAPD扩增差异片段的获得  21-23
  3.5 S140引物扩增特异带片段单株检测  23
  3.6 S140引物扩增特异带片段的回收、纯化及测序结果  23-24
  3.7 S140引物扩增特异带片段同源性比较  24-27
  3.8 花椰菜灰绿色叶片正常株和绿色叶片突变株主要经济性状和净光合速率比较  27-29
    3.8.1 花椰菜灰绿色叶片正常株和绿色叶片突变株净光合速率的比较  27-28
    3.8.2 花椰菜灰绿色叶片正常株和绿色叶片突变株主要经济性状的调查  28-29
4 讨论  29-35
  4.1 影响随机扩增多态性(RAPD)分析技术稳定性的几个因素  29-32
    4.1.1 关于随机扩增多态性分析技术稳定性探讨  29
    4.1.2 影响随机扩增多态性(RAPD)分析技术稳定性的几个因素  29-32
  4.2 有关植物突变叶色的遗传规律研究  32-33
  4.3 分子标记在基因定位和克隆中的应用  33
  4.4 花椰菜叶色突变体在杂交育种中的应用探讨  33-34
  4.5 本试验进一步须做的工作  34-35
5 结论  35-36
6 参考文献  36-41
7 附录  41-43
8 在读期间发表的学术论文  43-54
9 作者简介  54-55
10 致谢  55-58

花椰菜叶色性状连锁的RAPD标记的研究

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