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利用磁性纳米粒子检测蛋清中抗生物素蛋白的方法研究

作　者: 胡欣
导　师: 马美湖
学　校: 华中农业大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 抗生物素蛋白磁性纳米粒子竞争法夹心法
分类号: TS253.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

抗生物素蛋白(Avidin)是鸡蛋蛋清中的一种天然存在的糖蛋白,因为其具有抗菌抗虫活性而得到广泛应用。随着Avidin的发展,需要灵敏度更高、操作更简便的蛋白检测方法。本文在制备磁性纳米粒子的基础上,分别建立了竞争法和夹心法检测蛋清中的Avidin,并且将这两种方法与荧光分光光度法比较。研究结果如下：采用溶剂热法制备Fe304磁性纳米粒子(MNPs),单因素实验得到最佳制备工艺条件为：0.2702 g FeCl3·6H2O和2.70 g NaAC(?)昆合溶解于20 mL乙二醇中,磁力搅拌30 min后加入0.50 g聚乙烯亚胺,磁力搅拌30 min得到均匀粘稠的反应前驱物。量取20 mL反应前驱物到反应釜中,200℃下反应时间12 h,自然冷却后取出用水和无水乙醇洗涤,真空干燥得到Fe304纳米粒子。上述最适工艺条件制备的Fe304纳米粒子通过红外图谱分析证明表面含有大量氨基,并且利用对硝基苯甲醛法测得表面氨基含量为14.97 nmol/mg,利用振动样品磁强计测得其饱和磁化强度为64.93 emu/g。根据TEM观察结果可知纳米粒子粒径为30 nm,分散性较好。将磁性纳米粒子与抗体偶联,讨论得到最佳偶联条件为：纳米粒子先用15%的戊二醛活化,活化后的纳米粒子在pH 7.4的0.05 M PBS中与抗体偶联,当抗体磁性粒子的质量比(μg:mg)为300：1时,抗体的连接效率最高,可以达到约50μg/mg。建立了基于磁性纳米粒子的测定Avidin的竞争结合法。并对实验条件进行优化,确定最适合Biotin-MNPs浓度为400μg/mL, HRP-Avidin稀释度为1：2000,并在测定此条件下Avidin的抑制曲线,由抑制曲线得到标准曲线,得到回归方程：y=-1.4193x+3.9729,相关系数R2=0.9838。该方法的最低检测限为79.4 ng/mL,检测范围为79.4-5000.0 ng/mL,批内变异系数为7.22%,批间变异系数为9.17%。与溶菌酶、BSA、卵白蛋白和卵转铁蛋白交叉反应率均小于0.2%。该方法的回收率在95%-122%之间。建立了基于磁性纳米粒子的测定Avidin夹心法。并对实验条件进行优化,确定免疫磁珠最适浓度为600μg/mL, HPP-Biotin最适稀释度为1：800,底物显色条件为室温下避光反应10 min,并在测定此条件下检测Avidin的标准曲线,以OD490为纵坐标,Avidin浓度的对数为横坐标,y=0.2725 x-0.7036,相关系数R2=0.9915。该方法的最低检测限为30 ng/mL,线性范围为31.2-10000.0 ng/mL,批内变异系数为3.49%,批间变异系数为4.40%。溶菌酶、BSA、卵白蛋白和卵转铁蛋白对应的OD490与相同浓度Avidin孔的OD490有明显差异,该方法的回收率在88.2%-99.4%之间。用三种方法测定的三个不同品种鸡蛋中的Avidin浓度都在42-60μg/mL左右。对荧光分光光度法和竞争法的检测结果进行相关性和配对t检验分析得到t=0.208,P>0.05；夹心法和荧光分光光度法的相关性和配对t检验分析结果为t=0.392,P>0.05。

全文目录

摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
缩略语表  13-14
第一章文献综述  14-28
  1 抗生物素蛋白性质及应用  14-19
    1.1 抗生素蛋白的发现  14
    1.2 抗生素蛋白的物理化学性质  14-17
    1.3 抗生物素蛋白的生物学特性及其应用  17-19
  2 抗生物素蛋白的测定  19-22
  3. 磁性纳米颗粒及其在分析检测中的应用  22-26
    3.1 磁性纳米颗粒  22-24
    3.2 磁性纳米颗粒在分析检测中的应用  24-26
  4 本课题立题意义和研究的主要内容  26-28
第二章溶剂热法制备氨基修饰的Fe_3O_4纳米粒子及其性能  28-42
  1 材料与方法  28-32
    1.1 材料  28-29
      1.1.1 主要试剂  28
      1.1.2 仪器设备  28-29
    1.2 方法  29-32
      1.2.1 磁性纳米粒子的制备工艺流程  29
      1.2.2 纳米粒子制备条件优化  29-30
      1.2.3 纳米粒子的测试表征  30-32
  2 结果与分析  32-39
    2.1 反应釜填充度对合成效果的影响  32-33
    2.2 合成时间对合成效果的影响  33-35
    2.3 Fe~(3+)初始浓度对合成效果的影响  35-36
    2.4 NaAC对合成效果的影响  36-38
    2.5 Fe_3O_4纳米粒子磁性表征  38-39
    2.6 Fe_3O_4纳米粒子的红外图谱  39
    2.7 纳米粒子表面氨基测定结果  39
  3 结论  39-40
  4 讨论  40-42
第三章 Fe_3O_4纳米粒子与抗体的偶联及偶联条件的优化  42-52
  1 材料与方法  42-45
    1.1 材料  42-43
      1.1.1 主要试剂  42
      1.1.2 仪器设备  42-43
    1.2 方法  43-45
      1.2.1 酶标抗体的标准曲线的绘制  43
      1.2.2 偶联介质对偶联效果的影响  43-44
      1.2.3 戊二醛浓度对偶联效果的影响  44
      1.2.4 pH对偶联效果的影响  44
      1.2.5 温度对偶联效果的影响  44-45
      1.2.6 反应时间对偶联效果的影响  45
      1.2.7 纳米粒子和抗体用量对偶联效果的影响  45
      1.2.8 牛血清蛋白浓度对封闭效果的影响  45
  2 结果与分析  45-50
    2.1 偶联介质对偶联效果的影响  45-46
    2.2 戊二醛浓度对偶联效果的影响  46
    2.3 pH对偶联效果的影响  46-47
    2.4 温度对偶联效果的影响  47-48
    2.5 反应时间对偶联效果的影响  48
    2.6 纳米粒子和抗体用量对偶联效果的影响  48-50
    2.7 牛血清蛋白浓度对封闭效果的影响  50
  3 结论  50
  4 讨论  50-52
第四章基于Fe_3O_4纳米粒子竞争法测定Avidin  52-64
  1 材料与方法  52-55
    1.1 材料  52-53
      1.1.1 主要试剂  52-53
      1.1.2 仪器设备  53
    1.2 方法  53-55
      1.2.1 活化生物素  53
      1.2.2 制备生物素化磁性纳米粒子及其鉴定  53-54
      1.2.3 酶标板的处理  54
      1.2.4 Avidin检测流程  54
      1.2.5 BNHS-MNPs最适浓度和HRP-Avidin最佳稀释度的确定  54
      1.2.6 标准曲线的制作  54-55
      1.2.7 方法学评价  55
      1.2.8 测定鸡蛋蛋清中的抗生物素含量  55
  2 结果与分析  55-61
    2.1 BNHS-MNPs的鉴定  55-56
    2.2 BNHS-MNPs最适浓度和HRP-Avidin最佳稀释度  56-57
    2.3 标准曲线的建立  57-58
    2.4 方法学评价  58-60
      2.4.1 特异性  58-59
      2.4.2 精密度  59-60
      2.4.3 测定该方法的最低检测限  60
      2.4.4 测定该方法的回收率  60
    2.5 测定蛋清中Avidin的含量  60-61
  3 结论  61-62
  4 讨论  62-64
第五章基于Fe_3O_4纳米粒子夹心法测定Avidin  64-74
  1 材料与方法  64-67
    1.1 材料  64-65
      1.1.1 主要试剂  64
      1.1.2 仪器设备  64-65
    1.2 方法  65-67
      1.2.1 制备免疫磁珠  65
      1.2.2 酶标板的处理  65
      1.2.3 夹心法检测基本步骤  65-66
      1.2.4 底物显色时间的选择  66
      1.2.5 免疫磁珠和HRP-Biotin工作浓度的确定  66
      1.2.6 标准曲线的制作  66
      1.2.7 最低检测限  66
      12.8 精密度  66-67
      1.2.9 特异性  67
      1.2.10 回收率  67
      1.2.11 测定鸡蛋蛋清中的Avidin含量  67
  2 结果与分析  67-71
    2.1 底物显色时间的选择  67-68
    2.2 免疫磁珠和HRP-Biotin工作浓度的确定  68-69
    2.3 标准曲线的制作及最低检测限  69
    2.4 精密度  69-70
    2.5 特异性  70-71
    2.6 回收率  71
    2.7 蛋清中Avidin测定结果  71
  3 结论  71-72
  4 讨论  72-74
第六章不同方法检测鸡蛋中的Avidin及方法学比较  74-82
  1 材料与方法  74-77
    1.1 材料  74-75
      1.1.1 鸡蛋  74
      1.1.2 试剂与药品  74-75
      1.13 实验仪器  75
    1.2 方法  75-77
      1.2.1 配制Biotin-4-荧光素和Avidin储备液  75
      1.2.2 荧光法检测Avidin标准曲线的建立  75-76
      1.2.3 检测鸡蛋清Avidin浓度  76-77
  2 结果与分析  77-80
    2.1 三个品种鸡蛋的基本指标  77
    2.2 蛋清中Avidin三种方法测定的结果  77-80
  3 结论  80-81
  4 讨论  81-82
第七章结论  82-84
参考文献  84-92
致谢  92-94
附录:研究生期间撰写的论文列表  94

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