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三种西瓜病毒的基因克隆及植物表达载体构建

作　者: 牛胜鸟
导　师: 刘庆元；于嘉林
学　校: 河南农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 西瓜病毒基因克隆序列植物表达载体
分类号: S436.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2000年
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内容摘要

本研究以从山西西瓜上分离纯化得到的西瓜花叶病毒2号(WMV-2)分离物为材料，用RT-PCR方法得到其外壳蛋白(CP)。基因的cDNA，经克隆和序列测定后，确认该基因是由846个核苷酸组成，可编码产生281个氨基酸。同源性比较分析结果表明，该基因的核苷酸序列及由此推导的氨基酸序列与已发表的4种WMV-2分离物CP基因相应序列同源性分别为92.8-93.9％和95.4-96.4％。WMV-2山西分离物CP的N端第10位氨基酸为Y，从而使对蚜传特性具有决定作用的结构域DAG改变为YAG。分别构建了含WMV-2 CP基因和ZYMV复制酶基因(NIb；缺失NIb保守序列GDD)的双价植物表达载体pBZW-31，含WMV-2CP基因、ZYMV复制酶基因(NIb；缺失GDD)和CMV复制酶基因(缺失GDD)的三价植物表达载体pBWCZ-44。并将此两种重组质粒分别转入根癌农杆菌菌株LBA4404中，供植物转化使用。

全文目录

中文摘要  5-6
1 文献综述  6-16
  1．1 西瓜病毒的研究概况  6-7
  1．2 马铃薯Y病毒属的分子生物学  7-9
  1．3 植物病毒外壳蛋白和复制酶介导的抗性  9-16
    1．3．1 外壳蛋白介导的抗性  10-12
    1．3．2 复制酶介导的抗性  12-14
    1．3．3 复合基因介导的抗性  14-16
2 引言  16-18
3 材料与方法  18-28
  3．1 材料  18-19
    3．1．1 病毒  18
    3．1．2 细菌菌株  18
    3．1．3 质粒  18
    3．1．4 酶和试剂  18-19
    3．1．5 寡核苷酸引物  19
  3．2 方法  19-28
    3．2．1 繁殖毒源  19-20
    3．2．2 病毒的粗提纯  20
    3．2．3 病毒RNA的提取  20
    3．2．4 RT-PCR  20-21
    3．2．5 PCR产物的抽提  21-22
    3．2．6 目的DNA片段的回收纯化-液氮冻融法  22
    3．2．7 质粒DNA的酶切和连接反应  22
    3．2．8 DNA补平反应  22-23
    3．2．9 转化大肠杆菌  23
    3．2．10 重组克隆的筛选  23-25
    3．2．11 质粒DNA的大量提取  25-26
    3．2．12 DNA序列分析  26-27
    3．2．13 转化根癌农杆菌  27-28
4 结果与分析  28-40
  4．1 WMV-2的粗提纯  28
  4．2 WMV-2 RNA的提取  28-29
  4．3 WMV-2 CP基因的RT-PCR  29
  4．4 WMV-2 CP片段的克隆  29-30
  4．5 WMV-2 CP片段的序列分析  30-32
  4．6 双价植物表达载体pBZW-31的构建  32-34
    4．6．1 单价植物表达载体的构建  32-33
    4．6．2 中间载体的构建  33-34
    4．6．3 双价植物表达载体的构建  34
  4．7 三价植物表达载体的构建  34-38
    4．7．1 中间载体的构建  35-37
    4．7．2 单价植物表达载体的构建  37
    4．7．3 双价植物表达载体的构建  37-38
    4．7．4 三价植物表达载体的构建  38
  4．8 转化根癌农杆菌  38-40
5 结论与讨论  40-43
  5．1 WMV-2 CP片段的序列分析  40
  5．2 本研究中载体的构建特点  40-41
  5．3 转基因西瓜的安全性讨论  41
  5．4 大载体和目的片段的平端连接  41
  5．5 PCR检测  41-42
  5．6 根癌农杆菌的转化  42-43
参考文献  43-47
英文摘要  47-49
附录：  49-51
  1 ABBREVIATION（缩略词）  49-50
  2 本论文构建的西瓜病毒基因有关载体  50-51
致谢  51

三种西瓜病毒的基因克隆及植物表达载体构建

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