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产几丁质酶木霉菌菌株筛选及特性的研究

作　者: 李华
导　师: 刘开启
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 木霉菌（Trichoderma spp.）几丁质酶活性测定方法
分类号: Q939.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
下　载: 320次
引　用: 3次
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内容摘要

采集云南省玉溪、文山、大理、丽江、楚雄、遵义等6市土样49份，分离纯化木霉菌，获得118个菌株。改进的查氏酵母浸膏培养基分离木霉菌的效果较好。用KH2PO4替代查氏酵母浸膏培养基中的K2HPO4，并且增加KH2PO4的量，使培养基偏酸性，抑制了细菌等杂菌的生长；而且此培养基颜色较深，木霉菌菌落边缘的放射状菌丝及孢子颜色等特征明显，容易辨别木霉菌菌落。对稀释平板法、直接稀释法、诱捕法进行了比较，结果表明直接稀释法和诱捕法分离木霉菌的效果较好，诱捕法的效果最好，易于获得目的菌株。与稀释平板法比较，直接稀释法和诱捕法尤其适用于处理大批量的土样。首次采用还原糖法测定木霉菌产几丁质酶特性。在以几丁质酶的底物——几丁质（胶状几丁质）为唯一碳源的液体培养基中进行木霉菌发酵培养，发酵上清液与胶态几丁质37oC保温30min后与3，5-二硝基水杨酸试剂在100oC水浴中反应，以反应后颜色的变化，确定发酵液中几丁质酶的有无及数量。与常规采用的透明圈法相比，还原糖法较为直观、准确。应用还原糖法进行产几丁质酶木霉菌的筛选，关键在于发酵上清液中没有还原糖，即所有发酵上清液与DNS反应都没有颜色变化；这样只需比较发酵上清液和胶态几丁质混合保温后与DNS反应颜色的变化,即可确定发酵上清液中有无几丁质酶存在，辨别反应颜色的变化，比在半透明平板上辨别透明圈容易。在采用还原糖法进行产几丁质酶木霉菌筛选时，分别用几丁质和胶态几丁质作为木霉菌生长的唯一碳源，结果表明几丁质和胶态几丁质对木霉菌产几丁质酶的诱导效果不同，木霉菌产几丁质酶的量和酶活性存在差<WP=8>异。分离得到的118株木霉菌全都产几丁质酶。其中在以几丁质为唯一碳源时，15株木霉菌（TYM-1、TYM-2、TYM-8、TYM-10、TJQ-1、TJQ-2、THS-1、TCS-1、TWD-1、TYB-GL-1、TYZH-1、TCZ-DL-1、TCZ-DL-2、TXM-DL-5、TXM-DL-6）产几丁质酶活性高，11株木霉菌（TWD-2、TSQA-1、TSQC-3、TSQC-5、TBC-LJ-1、TSYL-LJ-1、TSYL-LJ-2、TSYL-LJ-4、TSYL-LJ-7、TSS-ZY-3、TBC-ZY-2）产几丁质酶活性低；在以胶态几丁质为唯一碳源时，7株木霉菌（TYM-4、TJQ-1、TYT-1、TYT-2、TYZH-1、TCZ-DL-3、TXM-DL-2）产几丁质酶活性高，10株木霉菌（TWD-4、TSQC-3、TXM-LJ-1、TXM-LJ-3、TYC-LJ-4、TSYL-LJ-1、TSYL-LJ-2、TSS-ZY-1、TSS-ZY-2、TBC-ZY-1）产几丁质酶活性低。选取29株木霉菌定量孢子接种发酵后测定几丁质酶的活性，与接种木霉菌菌落发酵测定几丁质酶活性的结果一致。在29株木霉菌中产几丁质酶最高的TYB-GL-1是用诱捕法获得的，表明用诱捕法获得木霉菌株的目的性强。选取29株木霉菌中产几丁质酶活性较高的4株木霉菌（TYB-GL-1、YWD-1、TXM-DL-6、TYM-2）和产几丁质酶活性较低的2株木霉菌（TBC-LJ-1、TSYL-LJ-7）分别与细交链孢菌、烟草疫霉、烟草炭疽菌、基生根串株霉以及瓜果腐霉对峙培养，结果表明木霉菌对病原菌的生防作用与木霉菌产几丁质酶活性的高低并没有直接相关性；对某个病原菌而言，产几丁质酶活性低的木霉菌株反而比产几丁质酶活性高的木霉菌株对病原菌的生防作用强。产几丁质酶木霉菌株对细胞壁含几丁质成分的病原菌与细胞壁无几丁质成分的病原菌的生防作用没有明显差别。

全文目录

中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
缩略词说明  12-13
文献综述一：木霉菌生长条件及分类研究进展  13-22
文献综述二：微生物几丁质酶在植物病害生物防治中的应用  22-30
引言  30-34
研究内容第一部分：土壤中木霉菌的筛选分离  34-43
  1 材料与方法  34-36
    1．1 土样的采集  34
      1．1．1 土样采集范围  34
      1．1．2 采集方法  34
    1．2 分离用培养基的制备  34-35
      1．2．1 土壤浸出液培养基Ⅰ  34
      1．2．2 土壤浸出液培养基Ⅱ  34
      1．2．3 PDA培养基  34
      1．2．4 查氏酵母浸膏培养基  34-35
      1．2．5 改进的查氏酵母浸膏培养基  35
    1．3 土样的处理方法  35-36
      1．3．1 稀释平板法  35
      1．3．2 直接稀释法  35
      1．3．3 诱捕法  35-36
    1．4 不同培养基的分离效果比较  36
    1．5 木霉菌的纯化与保存  36
  2 结果与分析  36-43
    2．1 分离用培养基的选择  36
    2．2 土样处理方法的选择  36
    2．3 土样的采集及分离木霉菌情况  36-38
    2．4 获得木霉菌的分布  38-43
研究内容第二部分：产几丁质酶木霉菌的筛选  43-48
  1 材料与方法  43-45
    1．1 菌株来源  43
    1．2 胶态几丁质制备  43-44
    1．3 3，5-二硝基水杨酸试剂制备  44
    1．4 培养基制备  44
      1．4．1 胶态几丁质培养基  44
      1．4．2 琼脂培养基  44
      1．4．3 发酵种子培养基  44
      1．4．4 发酵用培养液Ⅰ  44
      1．4．5 发酵用培养液Ⅱ  44
    1．5 测定方法  44-45
      1．5．1 透明圈法  45
      1．5．2 木霉菌发酵种子的培养  45
      1．5．3 木霉菌发酵培养  45
      1．5．4 还原糖法  45
  2 结果与分析  45-48
    2．1 透明圈法  45-46
    2．2 还原糖法  46-48
研究内容第三部分：产几丁质酶木霉菌特性的研究  48-55
  1 材料与方法  49-51
    1．1 供试木霉菌株  49
    1．2 发酵种子培养基  49-50
    1．3 产几丁质酶用培养基  50
    1．4 产几丁质酶木霉菌发酵种子的培养  50
    1．5 产几丁质酶木霉菌的液体发酵  50
    1．6 还原糖法测定发酵液中木霉几丁质酶活性  50
    1．7 木霉菌与植物病原真菌的作用  50-51
      1．7．1 供试菌株  50-51
      1．7．2 供试菌株与5种病原菌对峙培养  51
  2 结果与分析  51-55
    2．1 产几丁质酶木霉菌的液体发酵  51-53
    2．2 高产几丁质酶木霉菌株对病原菌的拮抗作用  53-55
      2．2．1 6 株木霉菌对烟草炭疽菌的作用  53
      2．2．2 6 株木霉菌对细交链孢菌的拮抗作用  53
      2．2．3 6 株木霉菌对烟草疫霉的拮抗作用  53
      2．2．4 6 株木霉菌对基生根串株霉的拮抗作用  53-54
      2．2．5 6 株木霉菌对瓜果腐霉的拮抗作用  54-55
讨论  55-57
结论  57-58
参考文献  58-68
附录  68-71
致谢  71-72
攻读学位期间发表的论文目录及对应章节  72

产几丁质酶木霉菌菌株筛选及特性的研究

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