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花生藤中白藜芦醇的提取分离及抗氧化活性研究

作　者: 王彩霞
导　师: 吴向阳
学　校: 江苏大学
专　业: 食品科学与工程
关键词: 花生藤 白藜芦醇 HPLC分析 提取工艺 双水相 纯化 抗氧化
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


白藜芦醇（Resveratrol,简称Res）,又称菧三酚,化学名为反式-3,4’,5-三羟基-1,2-二苯乙烯（3,4’,5-trihydrolystilbence）,广泛存在于天然植物体内,如虎杖、葡萄（皮、籽）、桑葚、花生、凤梨等,它是植物体内用于抵抗病原侵染的多酚物质,具有抗氧化、降血脂、预防心脑血管疾病以及抗癌等重要生物活性。以白黎芦醇提取物生产的功能食品在国际市场上深受欢迎,市场需求量大。目前国外主要从葡萄和葡萄籽中进行提取,国内则主要从中药虎杖中提取,但都面临原料资源紧缺、成本高等问题。据报道花生根茎叶中均含有白藜芦醇,而且含量比在葡萄皮（籽）中高数十倍到数百倍,但是目前花生藤还无工业规模利用,只有部分用作动物饲料,其余作为废弃物丢弃,或燃烧于田间,既浪费了农业资源,又造成环境污染。因此,研究和开发花生藤（包括花生根、茎、叶）中的白藜芦醇对扩大白藜芦醇的植物资源及提高花生副产品的经济价值都具有重要意义。本文以花生藤为原料,对花生藤中白藜芦醇的分析方法、提取工艺、分离纯化及抗氧化活性等进行研究,为花生藤的开发利用提供依据。主要内容如下:研究花生藤中白藜芦醇的高效液相色谱（HPLC）分析方法。花生藤提取物中杂质多,尤其是脂溶性杂质对色谱柱污染大,严重影响色谱柱的使用寿命,建立花生根、茎、叶一步硅胶柱预处理、HPLC法测定其中白藜芦醇含量的方法。预处理采用氯仿:丙酮:乙醇:水（4:4:0.5:0.2,V/V/V/V）洗脱,TLC法跟踪鉴定,收集白藜芦醇组分HPLC法分析。色谱条件为:色谱柱为Hypersil ODS-2（4.6mm×250mm,5μm）,流动相为甲醇:水（45:55,V/V）,流速为0.8mL/min,柱温为35℃,紫外检测波长为306nm。回归方程为:Y=9×106X-340693,线性范围:0.228-1.14μg（其相关系数R=0.9999）。经过一步硅胶柱预处理,HPLC检测色谱图中除了白藜芦醇峰外,杂质峰很少,预处理净化效果好。该方法简便,快速,准确。测得山东、江苏和河北产花生藤混合物中白藜芦醇的含量分别为903.69μg/g,116.21μg/g和88.69μg/g;以山东产花生藤含量为最高,高于文献报道。对山东产花生藤不同部位花生根、茎、叶中白藜芦醇的含量进行了测定,结果分别为223.08μg/g,1211.19μg/g和429.79μg/g,以茎中含量为最高。研究花生藤中白藜芦醇溶剂提取法的优化工艺。目前关于花生藤提取工艺优化的报道不多,且多用紫外分光光度法测定白藜芦醇的含量。经作者HPLC检测发现在波长306nm处花生藤提取样品在4min前有一大的杂质峰,杂质的峰面积大大高于白藜芦醇的峰面积,如用紫外分光光度法测定则不能准确反映白藜芦醇的提取量,因此本文采用传统的溶剂浸提法提取白藜芦醇,以白藜芦醇的提取量为考察指标,HPLC法测定提取样品中白藜芦醇的提取量,在单因素实验的基础上,进行正交实验,考察温度、乙醇浓度和液料比对白藜芦醇提取效果的影响。温度是影响白藜芦醇的提取量的显著性因素,溶剂提取法的优化工艺参数为:温度50℃,乙醇浓度60%,液料比25:1,提取时间1h,提取次数1次,在此条件下测得白藜芦醇的提取量为855.05μg/g原料。3次验证试验表明该工艺稳定,可用于花生藤中白藜芦醇的提取。双水相体系萃取白藜芦醇的理论研究。已有文献报道利用双水相体系纯化虎杖中的白藜芦醇,但未见双水相体系萃取白藜芦醇的理论研究报道,因此本文以分配系数和回收率为考察指标,采用紫外分光光度法进行含量测定,确定萃取白藜芦醇的最佳双水相体系为乙醇-硫酸铵-水,并采用浊点滴定法确立了此双水相体系的溶解度相图,同时对影响双水相体系萃取白藜芦醇效果的因素进行了考察。研究结果表明乙醇和硫酸铵的质量分数是影响双水相萃取的主要因素。建立双水相萃取花生藤中白藜芦醇的工艺。经过双水相体系萃取、除盐反萃取工艺后,白藜芦醇集中在上层萃取液中且回收率为97.5%,HPLC法测得样品中白藜芦醇的含量为1.83%,与粗提物中白藜芦醇的含量（0.2%）相比,提高了9倍多。可见,此双水相体系纯化工艺不但避免使用乙酸乙酯等有毒试剂,而且提高了样品纯度,可用于花生藤中白藜芦醇的初步纯化。考察花生藤白藜芦醇粗提物、双水相纯化后样品和含量为96.93%的白藜芦醇样品的抗氧化活性,并与VC进行对比。采用分光光度法测定样品对2,2-二苯基-1-苦肼基自由基（DPPH·）,羟自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O2·-）的清除效果。结果表明花生藤白藜芦醇粗提物、双水相纯化后样品和含量为96.93%的白藜芦醇样品清除自由基的能力随样品浓度的增加而增强,样品浓度小于2.664mg/mL时花生藤白藜芦醇粗提物清除自由基的效果优于双水相纯化后样品,但不及含量为96.93%的白藜芦醇样品;样品浓度达到2.664mg/mL后,三个样品清除自由基的能力趋于一致。花生藤白藜芦醇粗提物清除DPPH·、·OH和O2·-自由基的IC50值分别为0.0529mg/mL、0.589mg/mL和0.610mg/mL;双水相纯化后样品清除DPPH·、·OH和O2·-自由基的IC50值分别为0.0625 mg/mL、1.684 mg/mL和2.469mg/mL;含量为96.93%的白藜芦醇样品清除DPPH·、·OH和O2·-自由基的IC50值分别为0.00624mg/mL、0.485mg/mL和0.200mg/mL;VC清除DPPH·、·OH和O2·-自由基的IC50值分别为0.009 mg/mL、0.255mg/mL和0.190mg/mL,可见三个样品清除自由基的能力均稍弱于Vc;三个样品对DPPH·、·OH和O2·.的清除能力次序一致:含量为96.93%的白藜芦醇样品>花生藤白藜芦醇粗提物>双水相纯化后样品;含量为96.93%白藜芦醇样品清除自由基的效果与Vc的清除效果相当,花生藤白藜芦醇粗提物清除各自由基的效果与Vc的清除效果相近;双水相纯化后样品清除自由基的能力相对弱一些。

全文目录


摘要  5-8
ABSTRACT  8-15
第一章 绪论  15-32
  1.1 白藜芦醇的研究进展  15-28
    1.1.1 白藜芦醇的存在  16
    1.1.2 白藜芦醇的结构及性质  16-17
    1.1.3 白藜芦醇的药理作用  17-20
    1.1.4 白藜芦醇的定性、定量分析  20-22
    1.1.5 白藜芦醇的提取  22-26
    1.1.6 白藜芦醇的纯化  26-28
  1.2 花生藤中白藜芦醇的研究进展  28-30
  1.3 本课题研究的目的和意义  30-31
  1.4 本论文的主要研究内容  31-32
第二章 花生藤中白藜芦醇的分析方法研究  32-39
  2.1 材料与仪器  32-33
    2.1.1 材料与试剂  32
    2.1.2 仪器  32-33
  2.2 实验方法  33-34
    2.2.1 花生藤中白藜芦醇的提取  33
    2.2.2 花生藤提取样品的预净化处理  33
    2.2.3 白藜芦醇的定量测定  33-34
    2.2.4 HPLC法的方法学考察  34
    2.2.5 花生藤中白藜芦醇的测定  34
  2.3 结果与讨论  34-38
    2.3.1 检测波长的选择  34-35
    2.3.2 外标曲线的确定  35
    2.3.3 方法学评价  35-37
    2.3.4 花生藤中白藜芦醇的含量测定  37-38
  2.4 本章小结  38-39
第三章 花生藤中白藜芦醇的提取工艺研究  39-47
  3.1 材料与仪器  39
    3.1.1 材料与试剂  39
    3.1.2 仪器  39
  3.2 实验方法  39-40
    3.2.1 白藜芦醇的提取  39-40
    3.2.2 提取样品中白藜芦醇的含量测定  40
    3.2.3 单因素实验  40
    3.2.4 正交实验设计  40
  3.3 结果与讨论  40-46
    3.3.1 样品中白藜芦醇含量的测定  40-41
    3.3.2 单因素实验  41-44
    3.3.3 正交试验  44-46
  3.4 本章小结  46-47
第四章 白藜芦醇在双水相体系中的分配特性研究  47-56
  4.1 材料与仪器  47-48
    4.1.1 材料与试剂  47
    4.1.2 仪器  47-48
  4.2 实验方法  48-50
    4.2.1 双水相萃取原理  48
    4.2.2 分析方法  48-49
    4.2.3 双水相体系的选择  49
    4.2.4 双水相体系溶解度相图的确定  49
    4.2.5 影响白藜芦醇在双水相体系中萃取分配的因素考察  49-50
  4.3 结果与讨论  50-55
    4.3.1 标准曲线的制作  50
    4.3.2 双水相体系的选择  50-52
    4.3.3 双水相体系溶解度相图的确定  52-53
    4.3.4 影响白藜芦醇在双水相体系中萃取分离的因素考察  53-55
  4.4 本章小结  55-56
第五章 花生藤中白藜芦醇的双水相萃取纯化工艺及其抗氧化活性研究  56-64
  5.1 材料与仪器  56-57
    5.1.1 材料与试剂  56
    5.1.2 仪器  56-57
  5.2 实验方法  57-59
    5.2.1 花生藤白藜芦醇粗提物的制备  57
    5.2.2 双水相萃取花生藤白藜芦醇粗提物的工艺流程  57-58
    5.2.3 白藜芦醇含量分析方法  58
    5.2.4 白藜芦醇抗氧化活性研究  58-59
  5.3 结果与讨论  59-62
    5.3.1 双水相体系萃取花生藤白藜芦醇粗提物  59-60
    5.3.2 白藜芦醇抗氧化活性研究  60-62
  5.4 本章小结  62-64
第六章 结论与展望  64-66
  6.1 主要结论  64-65
  6.2 展望  65-66
附录  66-70
  附录 乙醇-硫酸铵-水双水相相图制作的部分数据  66-70
参考文献  70-76
致谢  76-77
攻读硕士学位期间发表的论文目录  77

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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