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砂梨主要病毒的快速检测及脱除技术研究

作　者: 邓晓云
导　师: 王国平；洪霓
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 砂梨 ACLSV ASGV ASPV 指示植物血清学分子生物学检测脱毒
分类号: S436.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

据报道梨病毒病对我国北方梨造成了严重损失。栽培无病毒苗木是当前解决梨病毒危害的有效途径，病毒检测是培育和繁殖无病毒苗木的重要环节。本试验以砂梨为材料，对苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)和苹果茎痘病毒(ASPV)三种梨树上重要病毒的快速检测方法和对带毒样品的脱毒技术进行了研究，取得了以下结果：在温室，通过汁液摩擦接种用草本指示植物检测10个待检砂梨样品，其中，8个表现ACLSV症状，2个表现ASGV症状，1个表现ASPV症状；通过二重芽接法用木本指示植物对以上10个样品进行检测，其中，5个表现ACLSV症状，3个表现ASGV症状，7个表现ASPV症状。结果表明，ACLSV采用草本指示植物检测，ASPV和ASGV采用木本指示植物检测，症状明显，结果更可靠。采用常规的PAS-ELISA、改进的PAS-ELISA和直接包被抗原ELISA(PTA-ELISA)，检测来源于苹果的ACLSV-C和梨的ASGV显示，通过将第二抗与酶标A蛋白预反应后混合加入，可降低非特异反应，提高阳性样品和阴性样品的吸光度比值(P／N)；常规PAS-ELISA与PTA-ELISA检测的结果一致。采用斑点免疫印迹法(Dot-ELISA)对梨样品等倍稀释检测ASGV，结果表明，稀释512倍后，阳性反应和阴性反应有明显差异，较改进的PAS-ELISA灵敏。用以上方法对待检梨样品木本材料及接种发病的草本指示植物均不能检测出ACLSV，这表明，梨样品所带的ACLSV可能与所用来源于苹果ACLSV-C的抗体血清学反应较弱。采用IC／TC-RT-PCR检测ACLSV-C接种的昆诺藜，均获得了约358bp的目标片段，但IC-RT-PCR所得扩增带相对较弱。采用以上两种方法及RT-PCR检测ASGV-3接种的昆诺藜，均获得了约499bp的目标片段，三种方法检测结果一致，相对于RT-PCR，前两种方法不用制备植物总核酸，简化了操作程序和要求。在此基础上，采用IC／TC-RT-PCR对梨样品的ACLSV和ASGV进行了检测，两种方法检测结果一致，但TC-RT-PCR检测ACLSV较IC-RT-PCR所得目标带拷贝数多，这亦可能是由以上所述ACLSV与所用抗体血清学反应较弱引起。用随机引物反转录，通过TC-RT-PCR检测ACLSV和ASGV复合感染的梨样品也均获得了目标片段。采用IC-RT-PCR检测2个梨样品的ASPV得到了较弱的约316bp的目标片段。采用茎尖分离获得田问砂梨样品的4个离体苗，对复合感染ACLSV、ASGV和ASPV的2个样品通过病毒净与茎尖培养相结合处理，采用改进的PAS-ELISA、Dot-ELISA和TC-RT-PCR检测9株继代脱毒苗，所有检测培养株均未脱除ACLSV，2个脱除了ASGV，1个脱除了ASPV。综上所述，本试验建立的梨病毒ACLSV和ASGV的分子生物学检测方法相对血清学检测结果更加稳定可靠，与指示植物检测结果基本一致，但抗体质量对IC-RT-PCR检测效果影响较明显，对ASPV的检测还有待完善。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-8
1 梨病毒及类病毒研究进展  8-17
  1.1 梨病毒及类脑毒种类及性质  8-12
    1.1.1 苹果褪绿叶斑病毒  8-9
    1.1.2 苹果茎沟病毒  9-11
    1.1.3 苹果茎痘病毒  11
    1.1.4 梨疱状溃疡类病毒  11-12
    1.1.5 苹果锈果类病毒  12
  1.2 检测技术  12-15
    1.2.1 生物学方法  12
    1.2.2 血清学技术  12-14
    1.2.3 分子生物学技术  14-15
  1.3 脱毒方法  15-16
    1.3.1 热处理脱毒法  15
    1.3.2 茎尖脱毒法  15-16
    1.3.3 热处理与茎尖培养结合脱毒法  16
    1.3.4 化学制剂与茎尖培养相结合脱毒法  16
  1.4 研究的目的和意义  16-17
2 砂梨病毒的生物学检测  17-24
  2.1 试验材料  17
    2.1.1 毒源材料  17
    2.1.2 待检砂梨样品  17
    2.1.3 指示植物  17
    2.1.4 接种缓冲液  17
  2.2 试验方法  17-18
    2.2.1 汁液摩擦接种  17
    2.2.2 二重芽接法  17-18
  2.3 结果与分析  18-21
    2.3.1 草本指示植物检测结果  18-19
    2.3.2 木本指示植物检测结果  19-20
    2.3.3 草本指示植物和木本指示植物检测结果比较  20
    2.3.4 接种缓冲液对病毒检测效果的影响  20-21
  2.4 结论与讨论  21-24
3 砂梨病毒的血清学检测  24-31
  3.1 试验材料  24
    3.1.1 检测材料  24
    3.1.2 标准毒源  24
    3.1.3 试剂  24
    3.1.4 样品提取缓冲液  24
  3.2 试验方法  24-26
    3.2.1 PAS-ELISA(Protein A sandwich ELISA)检测  24-25
    3.2.2 改进的PAS-ELISA检测  25
    3.2.3 直接包被抗原(Plate trapped antigen indirect ELISA，PTA-ELISA)检测  25
    3.2.4 DOt-ELISA  25-26
  3.3 结果与分析  26-30
    3.3.1 梨品种带毒状况的初步鉴定  26
    3.3.2 不同检测方法检测结果的比较  26-28
    3.3.3 样品最佳稀释倍数的确定  28
    3.3.4 提取缓冲液对病毒检测效果的影响  28-29
    3.3.5 不同材料检测效果的比较  29-30
    3.3.6 改进PAS-ELISA方法检测ASGV和ASPV最佳条件  30
  3.4 结论与讨论  30-31
4 砂梨病毒的分子生物学检测  31-38
  4.1 试验材料  31
    4.1.1 待检材料  31
    4.1.2 标准毒源  31
    4.1.3 抗体和主要试剂  31
    4.1.4 引物  31
  4.2 试验方法  31-34
    4.2.1 标准毒源病叶总核酸的提取  31-32
    4.2.2 反转录合成第一链cDNA  32
    4.2.3 PCR扩增  32
    4.2.4 IC-RT-PCR(Immunocapture IC-RT-PCR)  32-33
    4.2.5 TC-RT-PCR(Tube capture TC-RT-PCR)  33
    4.2.6 PCR产物的电泳分析  33-34
  4.3 结果与分析  34-37
    4.3.1 RT-PCR、IC-RT-PCR、TC-RT-PCR检测标准毒源结果  34
    4.3.2 ASGV检测结果  34-35
    4.3.3 ACLSV检测结果  35-36
    4.3.4 ASPV检测结果  36
    4.3.5 ASGV和ACLSV复合侵染样品的检测结果  36-37
  4.4 结论与讨论  37-38
5 砂梨病毒脱毒处理  38-42
  5.1 试验材料  38
    5.1.1 脱毒材料  38
    5.1.2 培养基  38
    5.1.3 病毒抑制剂  38
  5.2 试验方法  38-39
    5.2.1 茎尖培养  38
    5.2.2 茎尖在添加病毒净培养基上培养处理  38
    5.2.3 培养条件  38
    5.2.4 病毒脱除效果的鉴定  38-39
  5.3 结果与分析  39-41
    5.3.1 茎尖培养结果  39
    5.3.2 茎尖在添加病毒净培养基上培养结果  39
    5.3.3 茎尖在添加病毒净培养基上培养处理病毒脱除结果  39-41
  5.4 结论与讨论  41-42
6 砂梨病毒检测方法的综合比较  42-44
  6.1 田间样品的病毒检测结果  42
  6.2 脱毒苗的病毒检测结果  42-43
  6.3 结论与讨论  43-44
附录. 试验所用常规溶液配方  44-46
参考文献  46-49
致谢  49

砂梨主要病毒的快速检测及脱除技术研究

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