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瘦素对大鼠骨髓基质干细胞向软骨细胞分化过程及IGF-1表达的影响

作　者: 李建林
导　师: 赵文国
学　校: 华北煤炭医学院
专　业: 外科学
关键词: 瘦素骨髓基质干细胞软骨细胞 Ⅱ型胶原 IGF-1
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

关节软骨主要由软骨细胞和细胞基质构成,其功能是传导及分布载荷、维持和承受关节面的接触应力。关节软骨是无血管、淋巴管和神经的组织,所以自我修复能力相当有限,轻微伤害就有可能导致渐进式的损伤。关节软骨缺损的修复是临床上很棘手的问题。组织工程方法的出现给人们提供了可能最终解决问题的理想途径。以往构建的组织工程化软骨多选用软骨细胞作为种子细胞,存在着许多缺点:如供区功能障碍,获得细胞量小,细胞在体外扩增过程中易发生去分化,而异体软骨细胞存在着免疫原性及潜在携带病毒的可能性。而骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)作为软骨细胞的前提细胞,来源易得,取材方便,增殖能力强,可在体外大规模扩增而不丢失多分化潜能,并且异体移植时排斥反应小。它是一类具有多向分化潜能的干细胞,有自我复制、高度增殖和多向分化的能力,在特定培养条件下可向骨、软骨、神经胶质细胞、心肌、骨胳肌、脂肪细胞、血管内皮细胞等间叶组织细胞转化,故又将这些细胞称为间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)。BMSCs向软骨诱导分化的方法已较成熟,被认为是软骨组织工程最有价值的种子细胞。在体内外向软骨细胞分化增殖过程中常需要某些特定因子的作用,如TGF-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenet- ic protein, BMP)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)等。它们通过自分泌、旁分泌等方式,作用在BMSCs向软骨细胞诱导分化的各个阶段。IGF是一类结构上类似于胰岛素原的多肽,由骨、软骨和其他多种组织合成,对多种组织和细胞起有丝分裂原作用。IGF能促进软骨细胞分裂增殖,增强细胞功能,促进蛋白多糖及II型胶原的合成。Madry等研究表明IGF-1可促进BMSCs向软骨细胞分化,还可抑制TGF-β1引起的细胞外焦磷酸盐的积聚,防止焦磷酸钙结晶的形成和进一步成骨,是TGF-β1重要的辅助因子。临床观察显示,成人血清瘦素水平与循环中的IGF-1呈显著正相关。瘦素是一种由肥胖基因(ob)编码、白色脂肪组织产生的低分子量多肽蛋白,参与调节能量代谢、食欲和生长发育。近年来,国内外对瘦素的研究涉及多个领域,发现瘦素与多种疾病包括肥胖、糖尿病、高血压、肾功能衰竭、骨质疏松、乳腺癌等都有密切关系。Cornish等证实人类关节软骨细胞上存在瘦素受体,瘦素还能促进羊和狗软骨细胞的增殖,对成年小鼠全身应用瘦素能增加骨骺生长板的厚度。将瘦素注入大鼠的膝关节后,可以刺激两种软骨生长因子,即IGF和TGF-β的表达,继而增加蛋白多糖的合成。Maor等认为,在离体培养中,瘦素可通过直接作用于生长板软骨细胞上的受体,来促进软骨细胞前体细胞的增殖,增加下颌骨髁软骨细胞的增殖和分化活性,其中,IGF-1通路可能起着重要的介导作用。故我们可以推测,瘦素可能通过IGF-1影响BMSCs的软骨化过程,促进细胞外基质的合成。目前关于瘦素对BMSCs的作用报道还较少,本实验采用瘦素对体外培养的大鼠BMSCs进行干预,观察细胞的增殖及细胞内IGF-1以及细胞外基质的表达情况,以了解瘦素对于体外培养的大鼠BMSCs的作用及其机制,为临床上瘦素参与软骨损伤的修复提供一定的理论依据。目的本课题旨在探讨:1.在体外培养的大鼠BMSCs向软骨细胞分化早期(<72h),瘦素对大鼠BMSCs增殖的影响;2.在基因水平测定不同浓度瘦素对BMSCs向软骨细胞分化过程中IGF-1表达的影响;3.瘦素作用于体外培养的大鼠BMSCs向软骨细胞分化过程中的最适效应浓度。综合以上结果,探讨瘦素在BMSCs向软骨细胞诱导分化中的影响及其作用机制,从而更好地指导临床治疗骨性关节炎(osteoarthritis,OA)及促进软骨组织工程的发展。方法1采用体外细胞培养方法,选用4周龄SD大鼠的BMSCs作为实验研究材料。2对培养的大鼠BMSCs进行形态观察。3将培养的BMSCs传代至3代,随机分为6组,第1组为空白组,加入诱导培养基(DMEM, 5﹪胎牛血清,含重组人TGF-β1 10 ug/L,地塞米松10-7 mol/L ,维生素C 50μg/L),后5组为实验组,分别加入含0.1 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、1000 ng/ml瘦素的诱导培养基。4用MTT法测定不同浓度瘦素作用于体外培养BMSCs的细胞增殖情况。5采用免疫细胞化学法检测不同浓度瘦素作用于体外定向诱导培养BMSCs是否分泌II型胶原。6采用PCR法检测不同浓度瘦素作用于体外定向诱导培养BMSCs表达IGF-1的情况。7用SPSS15.0软件对结果进行统计学分析。结果1采用细胞体外培养方法成功培养BMSCs,并通过形态观察得到证实。采用免疫细胞化学法证明转化后的细胞为软骨细胞。2在前24h,各实验组细胞的增殖情况均与对照组有显著差异(P<0.05);在48h~72h,加入10 ng/ml浓度瘦素的实验组OD值明显增高,与其他各组均有显著差异(P<0.05)。3经瘦素刺激的各实验组定向诱导培养BMSCs表达IGF-1具有不同程度的增加,最大效应浓度为10ng/ml,而高浓度的瘦素的促进作用并不明显。结论1瘦素在BMSCs向软骨细胞分化早期可以促进细胞增殖。2瘦素可通过提高BMSCs中IGF-1的表达,对BMSCs向软骨细胞定向分化起到促进作用。

全文目录

中文摘要  3-7
英文摘要  7-12
英文缩写  12-13
研究论文：瘦素对大鼠骨髓基质干细胞向软骨细胞分化过程及IGF- 1表达的影响  13-40
  前言  13-15
  材料和方法  15-24
  结果  24-28
  讨论  28-34
  小结  34-35
  不足与展望  35-36
  参考文献  36-40
实验附图  40-43
综述纳米技术和材料在软骨组织工程中的应用  43-50
  参考文摘  48-50
致谢  50-51
个人简历  51

瘦素对大鼠骨髓基质干细胞向软骨细胞分化过程及IGF-1表达的影响

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