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气道上皮高表达mCLCA3与哮喘小鼠气道炎症的关系

作　者: 何丽
导　师: 张惠兰；赵建平
学　校: 华中科技大学
专　业: 内科学
关键词: 哮喘 气道上皮细胞 mCLCA3 气道免疫 气道炎症 SPA启动子 靶向表达
分类号: R562.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的:研究哮喘相关基因mCLCA3在哮喘小鼠模型中的梯度变化及其与Th1/Th2细胞因子和趋化因子的关系,并分析其在哮喘气道炎症中的作用。方法:30只SPF级BALB/ C小鼠随机分为五组,每组6只(n=6):D(致敏而未激发),E(激发1天),F(激发3天),G(激发5天),H(激发7天)。通过RT-PCR和免疫组化分别检测肺组织中mCLCA3的mRNA和蛋白表达水平及蛋白定位。采用肺组织切片的HE染色、肺泡灌洗液中炎症细胞分类计数、流式细胞术检测肺组织单个核细胞中CD4+T淋巴细胞比例改变来评价肺部炎症细胞浸润情况。RT-PCR法和流式细胞术胞内因子染色检测肺组织IL-4和IFN-γ的mRNA和蛋白表达。ELISA检测炎症局部不同趋化因子的蛋白表达水平。结果:RT-PCR和免疫组化结果均表明激发组较未激发组mCLCA3表达增加,并且mCLCA3的表达量随激发次数增加而增加具有激发时间依赖性(p< 0.05)且免疫组化提示mCLCA3仅仅表达于哮喘小鼠的气道上皮。与未激发组小鼠相比(D组),激发组的小鼠肺组织和肺泡灌洗液中的炎症细胞浸润数均显著增加。随着激发次数的增多,肺组织中Th1和Th2细胞因子IL-4和IFN-γ均有不同程度升高,其中激发最多组(H组)IL-4与其余各组差异有统计学意义而各组IFN-γ差异无统计学意义。ELISA结果显示随着激发次数的增加小鼠BALFCCL17、CCL22均有增加趋势,其中G、H组CCL17,H组CCL22差异较其余组有统计学意义;激发多次的小鼠(F、G、H组)BALF中CCL5有增加趋势,但增加的差异无统计学意义。相关性分析表明:mCLCA3与BALF中CCL17(r=0.584, p<0.01)、CCL22(r=0.461, p<0.05)均成正相关;E、F、G组CCL5与mCLCA3(r= 0.736,p<0.01)亦成正相关。mCLCA3与BALF中总炎症细胞(r= 0.393,p<0.05)、嗜酸性粒细胞(r= 0.529,p<0.01)正相关,与肺组织中CD4+T细胞(r= -0.558,p<0.05)负相关;mCLCA3与肺组织淋巴细胞、单核-巨噬细胞及细胞因子IL-4和IFN-γmRNA水平均无明显相关性。结论:哮喘小鼠模型气道上皮中增加的mCLCA3表达可能通过参与气道上皮细胞趋化因子的分泌而介导炎症局部炎症细胞的浸润从而在气道炎症的发展中起重要作用。这一发现为我们进一步研究mCLCA3在肺组织炎症中的作用提供了新的线索。目的:构建腺病毒穿梭质粒pDC315-SPA-mCLCA3融合基因表达载体,分析其在气道上皮细胞系的靶向表达。方法:PCR法从PGL-SPA和pCR-BluntII-TOPO载体中克隆全长2948bp的SPA-mCLCA3基因序列并将其亚克隆入pDC315-EGFP载体,构建pDC315-SPA-mCLCA3靶向表达载体。测序鉴定正确后分别转染气道上皮细胞系(H441)和非气道上皮细胞系(293)。每种细胞分pDC315-EGFP组(对照组:GFP阳性,mCLCA3阴性)和pDC315-SPA-mCLCA3组(mCLCA3阳性组),分析mCLCA3在不同上皮细胞的表达水平。结果:测序结果证实成功构建含有气道上皮细胞特异性启动子SPA的mCLCA3重组质粒。靶向表达分析表明mCLCA3 mRNA在高表达SPA的气道上皮细胞系(H441)中表达显著高于其在非气道上皮细胞系(293)的表达(p<0.05);免疫细胞化学表明H441细胞pDC315-SPA-mCLCA3质粒转染组中mCLCA3蛋白表达阳性而对照质粒组表达阴性。结论:成功构建气道上皮细胞靶向表达mCLCA3基因的重组腺病毒穿梭载体pDC315-SPA-mCLCA3,为后续构建腺病毒靶向载体Ad -SPA-mCLCA3及研究mCLCA3在气道上皮缺陷中的作用提供实验基础。

全文目录


缩略词表  5-6
前言  6-8
中文摘要  8-11
Abstract  11-15
第一部分 m CLCA3 在哮喘小鼠气道上皮细胞的时间依赖性表达及其与趋化因子和Th  15-40
  1. 材料与方法  15-24
  2. 结果  24-27
  3. 讨论  27-30
  4. 参考文献  30-33
  5. 附图  33-40
第二部分 PDC315-SPA-mCLCA3 载体的构建及其在气道上皮细胞的靶向表达分析  40-54
  1. 材料与方法  40-47
  2. 结果  47-48
  3. 讨论  48-50
  4. 参考文献  50-51
  5. 附图  51-54
附录1 攻读硕士学位期间撰写文章及发表情况  54-55
致谢  55-56

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 呼吸系及胸部疾病 > 气管和支气管疾病 > 支气管疾病 > 支气管哮喘
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