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siRNA沉默Sox-9基因对骨骺干细胞生物学性状影响的实验研究

作　者: 陈少坚
导　师: 陈安民
学　校: 华中科技大学
专　业: 外科学
关键词: 软骨组织工程骨骺干细胞 siRNA干扰 Sox9基因
分类号: R684
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 28次
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内容摘要

目的探讨siRNA沉默Sox-9基因对骨骺干细胞增殖、凋亡及向软骨方向分化等生物学性状的影响,了解Sox-9基因对骨骺干细胞细胞因子PTHrP、Ihh及软骨细胞外基质如Col2α1、aggrecan调控的相关分子机制。方法在显微手术方法辅助下,从新生24小时内的SD大鼠股骨干骺端的软骨膜环(La Croix环)中采用酶消化法分离、免疫磁珠法纯化、并利用细胞相对特异性标志物FGFR-3进行免疫组化和免疫荧光鉴定得到骨骺干细胞;选择生长状态良好的细胞首先进行转染荧光标记的Sox-9 siRNA,荧光显微镜下观察判断转染效率,确定最佳转染条件,进一步进行实验分组,共分成2组:第1组空白对照组:常规培养细胞;第2组实验干预组:Sox-9 siRNA通过Lipofectamine 2000转染干扰骨骺干细胞。分组实验操作后继续培养,于24h、48h、72h三个时间点用MTT检测细胞增殖情况,于培养后48h流式技术Annexin_V-FITC&PI进行凋亡检测、RT-PCR检测Sox-9、Col2α1、aggrecan、PTHrP、Ihh指标表达变化。根据实验结果评价Sox-9 siRNA转染效率及其干扰Sox-9基因对骨骺干细胞增殖、凋亡及向软骨方向分化的影响。结果1.分离、纯化得到生长状态稳定、贴壁牢固的原代骨骺干细胞,镜下多呈梭形;2.免疫组化、免疫荧光鉴定显示细胞稳定表达相对特异性标志物FGFR-3;3.转染预实验显示所有转染组转染效率均在80%以上,可以做后续实验;4. MTT检测结果显示实验组细胞增殖较对照组降低(p < 0.05);5.流式凋亡检测显示实验组较对照组凋亡增加;6. RT-PCR检测结果显示实验组Sox-9、Col2α1、aggrecan、PTHrP表达较空白对照组降低,Ihh表达无明显改变。结论siRNA通过转染可高效沉默骨骺干细胞Sox-9基因表达,对其细胞增殖起抑制作用并促进细胞凋亡,且对软骨细胞外基质Col2α1、aggrecan基因表达有明显的抑制作用,PTHrP表达同样减低,提示RNA干扰Sox-9基因对骨骺干细胞增殖的影响可能通过抑制PTHrP表达来进行调控,而对Ihh表达无明显影响,通过以上结果显示Sox-9基因对骨骺干细胞的调控起着重要作用,对其进一步的研究对骨骺干细胞作为软骨组织工程种子细胞有深远的意义。

全文目录

前言  5-8
中文摘要  8-9
Abstract  9-11
引言  11-12
材料与方法  12-25
实验结果  25-30
讨论  30-33
小结  33-34
参考文献  34-40
综述  40-50
  参考文献  45-50
缩略词索引  50-51
致谢  51-52

siRNA沉默Sox-9基因对骨骺干细胞生物学性状影响的实验研究

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