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C57BL/6J和C3H/HeN小鼠放射性肺损伤进程差异及其机制的研究

作　者: 刘英
导　师: 彭瑞云；李杨
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 放射肺损伤 C57BL/6J小鼠 C3H/HeN小鼠抗体芯片 Raf1
分类号: R818.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的意义：肺纤维化可由物理、化学和生物等因素所导致，以胶原沉积增多为特征，临床表现为进行性呼吸困难乃至呼吸衰竭而死亡。迄今，其分子机制尚未阐明，仍无有效的防治措施。肺纤维化的发生发展具有明显的种属和个体差异，但存在此种差异的机制仍未揭示。因此，本课题在研究C57BL／6J和C3H／HeN小鼠RPI进程差异的基础上，应用抗体芯片和组织芯片等技术，探讨其差异存在的机制，寻找肺纤维化易发相关分子，并作为该病防治的新靶点，以期进一步揭示该病分子机制并探寻和验证防治新措施。材料和方法：（1）20Gy ⁶⁰Coγ射线照射C57BL／6J和C3H／HeN小鼠各30只，于照后1、3和6m，应用HE及天狼猩红染色、免疫组化和组织芯片等方法，检测Ⅰ和Ⅲ型胶原表达、Hyp和嗜银蛋白含量以及FN、LN和α-SMA表达。（2）应用抗体芯片检测C57BL／6J和C3H／HeN小鼠照射前和照射后3m肺组织中蛋白表达的差异。（3）体外培养两种小鼠LFs，分别施加2、4、6和8Gyγ射线及10和30nmol／L Rafl激酶抑制剂Ⅰ，于照后6h、1、2及3d应用MTT、流式细胞术和免疫荧光细胞化学等方法检测细胞增殖活力、细胞周期、嗜银蛋白、α-SMA、MMP-1和TIMP-1表达。实验结果：（1）C57BL／6J小鼠照后1～6m肺组织病理改变经历间质性炎症、细胞增生和纤维化期，照后3和6mⅠ和Ⅲ型胶原沉积和Hyp含量显著增多，FN于照后1和3m显著增高，6m减少，LN于照后6m内进行性增加，α-SMA于照后3和6m较C3H／HeN小鼠显著增多；C3H／HeN小鼠照后1～6m肺组织为间质性炎症改变，未见胶原沉积，Hyp含量和FN于照后6m内无明显变化，LN于照后1～3m明显增强，6m减少。（2）制备放射性肺损伤组织芯片，HE染色和FN、LN和α-SMA免疫组化染色的结果同普通切片染色具有良好的一致性。（3）C3H／HeN小鼠肺组织，于照射前高表达DLP1，照后3m高表达MST3和GSPT2；C57BL／6J小鼠肺组织，于照后3m高表达Rafl、TRF2和HO1。（4）2～8Gyγ射线照后3d内，C57BL／6J和C3H／HeN小鼠LFs增殖活力无明显变化。照后C57BL／6J小鼠LFs非整倍体增多，α-SMA高表达，MMP-1表达呈弱阳性，但TIMP-1的表达呈增强趋势；C3H／HeN小鼠LFs于照后3d内见G₂／M期阻滞，α-SMA表达减弱，MMP-1和TIMP-1表达均呈增强趋势。（5）Rafl激酶抑制剂Ⅰ作用于C57BL／6J小鼠LFs后，α-SMA表达减弱，未见非整倍体细胞增多。结论：（1）20Gy ⁶⁰Coγ射线照射成功建立易／抗放射性肺纤维化动物模型。C57BL／6J小鼠为易纤维化小鼠，而C3H／HeN小鼠为抗纤维化小鼠。（2）建立了放射性肺损伤组织芯片。（3）Rafl、TRF2和HO1与放射性肺纤维化的发生呈正相关，而MST3和GSPT2与放射性肺纤维化的发生呈负相关。（4）C57BL／6J和C3H／HeN小鼠LFs的不同表型、功能活性状态以及对照射的不同反应性，与二者易／抗肺纤维化有关。（5）Rafl激酶抑制剂Ⅰ可抑制C57BL／6J小鼠LFs的活性，对RPF有一定的防治作用。

全文目录

缩略词表  7-9
中文摘要  9-11
英文摘要  11-13
引言  13-18
主要仪器设备  18-19
第一部分 C57BL/6J和C3H/HeN小鼠放射性肺损伤进程的比较研究  19-37
  材料和方法  19-23
    一、实验动物与分组  19
    二、照射方法  19
    三、动物活杀取材与病理学检查  19
    四、肺组织芯片制作方法  19-21
    五、肺组织AgNORs染色  21
    六、免疫组织化学染色法检测肺组织中FN、LN和α-SMA的表达  21-22
    七、肺组织Hyp含量测定  22
    八、统计学处理  22-23
  结果  23-27
    一、C57BL/6J和C3H/HeN小鼠肺组织病理形态变化  23
    二、C57BL/6J和C3H/HeN小鼠肺组织Ⅰ和Ⅲ型胶原表达变化  23
    三、C57BL/6J和C3H/HeN小鼠肺组织Hyp含量变化  23-24
    四、C57BL/6J和C3H/HeN小鼠肺组织嗜银蛋白含量变化  24
    五、C57BL/6J和C3H/HeN小鼠肺组织中FN、LN和α-SMA的表达变化  24-26
    六、C57BL/6J和C3H/HeN小鼠放射性肺损伤组织芯片的建立  26-27
  讨论  27-32
    一、C57BL/6J和C3H/HeN两种小鼠放射性肺损伤进程的差异及意义  27-31
    二、放射性肺损伤组织芯片的建立、应用及意义  31-32
  结论  32
  参考文献  32-37
第二部分照射前后C57BL/6J和C3H/HeN小鼠肺组织差异蛋白的探寻和验证  37-61
  材料和方法  37-45
    一、实验动物及分组  37
    二、照射方法  37
    三、抗体芯片检测肺组织中差异蛋白  37-40
    四、免疫印迹法检测Rafl的表达  40-45
  结果  45-47
    一、C57BL/6J和C3H/HeN小鼠肺组织差异蛋白的抗体芯片检测结果  45-46
    二、C57BL/6J和C3H/HeN小鼠肺组织Rafl蛋白表达的变化  46-47
  讨论  47-54
    一、抗体芯片应用进展  47
    二、C57BL和C3H小鼠易/抗纤维化机制的研究进展  47-48
    三、C57BL/6J和C3H/HeN小鼠肺组织中差异表达的蛋白及其意义  48-54
  结论  54-55
  参考文献  55-61
第三部分 γ射线照射和Rafl激酶抑制剂Ⅰ对C57BL/6J和C3H/HeN小鼠LFs生物学行为影响的比较研究  61-79
  材料和方法  61-64
    一、C57BL/6J和C3H/HeN小鼠LFs的原代培养和鉴定  61-62
    二、LFs生长曲线的测定  62
    三、细胞处理方法  62-63
    四、MTT比色法检测细胞增殖活力  63
    五、LFs的AgNORs染色  63
    六、流式细胞术检测LFs的细胞周期  63-64
    七、免疫荧光细胞化学染色检测LFs中α-SMA、MMP-1和TIMP-1表达  64
    八、统计学处理  64
  结果  64-70
    一、LFs的形态变化及鉴定  64
    二、C57BL/6J和C3H/HeN小鼠LFs增殖活力的改变  64-66
    三、C57BL/6J和C3H/HeN小鼠LFs细胞周期的改变  66-67
    四、C57BL/6J和C3H/HeN小鼠LFs中α-SMA、MMP-1和TIMP-1的表达改变  67-68
    五、Rafl激酶抑制剂Ⅰ处理照后C57BL/6J小鼠LFs生物学行为的改变  68-70
  讨论  70-75
    一、γ射线照射对C57BL/6J和C3H/HeN小鼠LFs增殖活力的影响及意义  70-71
    二、γ射线照射对C57BL/6J和C3H/HeN小鼠LFs细胞周期的影响及意义  71-72
    三、γ射线照射对C57BL/6J和C3H/HeN小鼠LFs表型转化的影响及意义  72
    四、γ射线照射对C57BL/6J和C3H/HeN小鼠MMP-1和TIMP-1表达的影响及意义  72-73
    五、Rafl激酶抑制剂Ⅰ对照射后C57BL/6J小鼠LFs生物学行为的影响及意义  73-75
  结论  75-76
  参考文献  76-79
全文结论  79-80
致谢  80-82
附图  82-90
综述  90-98
附录1  98-99
附录2 在学期间发表的论文复印件  99-107

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