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安徽省猪圆环病毒病分子流行病学调查

作　者: 杨世兴
导　师: 魏建忠；范伟兴
学　校: 安徽农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪圆环病毒II型分子流行病学调查
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒II(PCV2)引起的猪的一种多个系统功能障碍的病毒性传染病。临床上以新生仔猪先天性脑震颤和断奶仔猪多系统衰竭综合征等为主要特征。猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome.PMWS)的病原体现已经被确认为猪圆环病毒(PCV2),除了引发PMWS外,PCV2还与猪皮炎肾病综合征( porcine dermatitis and nephropathy syndrome.PDNS)、新生仔猪先天性脑震颤(Congenital tremors.CT)、增生性坏死性肺炎(proliferative and necrotizing pneumonia.PNP)以及怀孕母猪的繁殖障碍(reproductive disorders)等病的发生有关,它已给世界养猪业造成了巨大的经济损失,因此了解目前国内猪圆环病毒的感染情况,对于我们进行预防、治疗,乃至疾病的研究至关重要。本研究根据安徽省的地理分布和养殖状况,从安徽不同地区采集猪组织器官样品进行流行病学调查。1.根据Genbank上已经发表的PCV2基因序列,选取其保守性高的ORF2在其内部设计一对引物(可扩增片段630bp的序列),对两株PCV2参考毒株进行PCR的检测,均能扩增出630bp的目的基因片段,而对PCV1、猪瘟病毒、鸡传染性贫血病毒均没有扩增出特异性目的条带。将PCV2参考毒株作不同倍数稀释后分别进行PCR扩增,当稀释至100倍,即5fg病毒的DNA含量时,仍可以扩增出特异性片段。应用本试验方法对采集于宿州、怀宁、阜阳、合肥四个地区的屠宰场生猪的脾、肺、肾、淋巴结各30份以及采集于华杰、舒城长风、巢湖雄业3个猪场的发病猪的脾、肺、肾、淋巴结各10份进行检测,结果表明:(1)不同地区屠宰场的生猪均有猪圆环病毒II感染,其中,宿州、合肥检出率为6.1%,阜阳的检出率为10%,而怀宁的检出率为23.3%。(2)对3个不同猪场发病猪的调查表明:舒城长风种猪场和巢湖雄业食品有限公司种猪场病猪的检出率均为20%,而华杰良种畜禽有限公司的检出率为70%。2.为了了解病毒的感染组织器官的带毒状况;分别对上述已检测为阳性的样品进行不同部位的检测;检测的部位包括脾、肺、肾、淋巴结等。结果显示不同部位均有阳性目的片段的检出,但不同部位的检出率不同。其中在检测的20份样品中,脾和淋巴结检出率均为100%,肺检出率为80%,肾的检出率为40%。从而表明病毒主要侵害免疫器官,这可能是造成猪免疫机能降低的原因。3.为了比较安徽地区检出的PCV2与国内外其它毒株的亲缘关系,对所检出的部分阳性样品进行PCR扩增,并对其进行序列测定和序列比较分析。通过序列测定表明本试验中的四个样品PCR产物的序列与GenBank上登陆的PCV2序列的同源性达90%以上,证明是PCV2。从系统发育树上可以看出;四个阳性样品之间的亲缘关系密切,它们组成的分支和一株英国毒株AY484416,共同组成另一个细小分支;同时这一分支又和DQ195679及AY556476、AY556473三个毒株关系较近,而与一株美国株(AY325495)、一株福建毒株(AY556474)共同组成的一个分支相距较远。

全文目录

中文摘要  3-5
Abstract  5-12
文献综述  12-21
  1 病原学  12-15
    1.1 分类地位和形态  12-13
    1.2 理化特性  13-14
    1.3 PCV2 的分子生物学特征  14-15
      1.3.1 病毒的基因组特征  14-15
      1.3.2 PCV2 的感染与免疫抑制  15
  2 流行病学  15-16
    2.1 流行情况及分布  15-16
    2.2 易感动物  16
    2.3 传播方式及途径  16
  3 PCV2 感染的病理变化  16-18
  4 PCV2 的诊断技术  18-20
    4.1 病毒的分离鉴定  18
    4.2 病毒抗原的检测技术  18-20
      4.2.1 免疫细胞化学及原位杂交技术  18-19
      4.2.2 PCR 技术  19-20
    4.3 病毒抗体的检测技术  20
      4.3.1 间接免疫荧光  20
      4.3.2 酶联免疫吸附实验  20
  5 PCV2 的防治  20-21
前言  21-22
安徽省猪圆环病毒病分子流行病学调查  22-41
  1. 材料与方法  22-27
    1.1 参考毒株  22
    1.2 病料  22
    1.3 引物  22
    1.4 主要试剂  22
    1.5 溶液配制  22-23
    1.6 主要仪器  23-24
    1.7 方法  24-27
      1.7.1 病料的采集和处理  24
      1.7.2 动物细胞总 DNA 的提取  24
      1.7.3 PCR 扩增  24-25
      1.7.4 PCR 扩增条件的优化  25
      1.7.5 PCR 特异性试验  25
      1.7.6 PCR 敏感性测定  25
      1.7.7 稳定性试验  25
      1.7.8 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳  25
      1.7.9 应用优化的 PCR 方法对病料进行检测  25
      1.7.10 不同地区屠宰生猪的检测  25
      1.7.11 不同猪场发病猪的检测  25
      1.7.12 不同组织器官的检测  25
      1.7.13 对屠宰场生猪和部分猪场的发病猪进行数据分析  25
      1.7.14 阳性样品的序列分析  25-26
      1.7.15 阳性样品 PCR 产物 ORF2 区段的部分核苷酸序列的测定  26
      1.7.16 阳性样品 PCR 产物 ORF2 序列测定结果的鉴定  26
      1.7.17 阳性样品 ORF2 区段的核苷酸序列系统进化关系分析  26
      1.7.18 阳性样品抗原潜在位点分析  26-27
  2 结果与分析  27-37
    2.1 PCR 条件的优化  27-29
      2.1.1 PCR 特异性试验  27
      2.1.2 PCR 敏感性试验  27-28
      2.1.3 稳定性试验  28
      2.1.4 临床病料的 PCR 检测  28-29
    2.2 安徽部分地区屠宰生猪的检测  29-31
    2.3 猪场发病猪的检测  31-32
    2.4 PCV2 阳性猪不同器官的检测  32
    2.5 各种数据统计分析结果  32-33
      2.5.1 对不同地区屠宰生猪的 PCV2 检出率的分析结果  32-33
      2.5.2 对不同猪场发病猪的 PCV2 检出率的分析结果  33
      2.5.3 屠宰生猪和猪场发病猪感染率的分析结果  33
      2.5.4 不同组织器官 PCV2 检出率的分析结果  33
    2.6 四个阳性病料的 PCR 扩增及序列测定分析  33-37
      2.6.1 四个阳性病料的 PCR 扩增结果  33
      2.6.2 阳性样品 PCR 产物序列与国内外参考株 ORF2 核苷酸序列比较分析  33-34
      2.6.3 从系统发育树上分析四个 PCV2 阳性样品系列与国内外参考毒株的关系  34-35
      2.6.4 阳性样品 PCR 产物 ORF2 的核苷酸序列及所编码的氨基酸序列分析  35
      2.6.5 阳性样品 PCR 产物 ORF2 与参考株 ORF2 潜在抗原位点比较  35-37
  3 讨论  37-40
    3.1 PCR 反应的特异性  37
    3.2 PCR 诊断方法的敏感性  37
    3.3 PCR 的稳定性  37
    3.4 PCV2 的流行性  37-38
    3.5 PCV2 的病理变化  38
    3.6 PCV2 的感染部位  38-39
    3.7 关于 PCV2 的 ORF2 抗原位点的讨论  39
    3.8 关于 PCV2 ORF2 核苷酸同源性及系统发生树的讨论  39-40
  结论  40-41
参考文献  41-48
附录  48-56
致谢  56-57
作者简介  57

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