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木质层孔菌产MnP培养体系优化及酶学性质研究

作　者: 陈聪
导　师: 曹福祥
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 木质层孔菌锰过氧化物酶培养分离纯化酶学性质
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本文以木质层孔菌(Fomes lignosus)为研究对象,首先对其培养条件进行优化,并采用发酵罐进行扩大培养,继而利用盐析、层析等技术将锰过氧化物酶(MnP)分离纯化,并进一步研究该酶的酶学性质。本文研究多种培养基组分及培养条件对木质层孔菌生产锰过氧化物酶(MnP)的影响。对培养条件进行优化,并采用正交设计法对培养基组分进行优化。优化培养条件为：pH 5,温度34℃,装液量150ml,葡萄糖：蛋白胨(C/C)20:1, Mn2+1.5 mmol/L,ABTS 0.5mmol/L,转速160r/min。通过正交实验分析培养木质层孔菌的主次因素,同时综合考虑各因素的交互作用。影响酶活因素的主次顺序为：葡萄糖/蛋白胨>转速(r/min)>ABTS(mmol/L)>Mn2+浓度。最高酶活力可达1042.76U/L,提高了7倍。较之单纯采用单因素方式优化培养基MnP活力提高了18.4%。采用发酵罐补料分批培养培养木质层孔菌,发酵罐中溶氧、转速及温度等参数都能得到很好的控制,菌体密度显著提高,摇瓶培养过程中锰过氧化物酶活性最高达到1042.76U/L左右,发酵罐培养的菌体锰过氧化物酶活性可以达到1222.34U/L,提高了17.2%。摇瓶培养过程中菌体菌体干重基本维持在1.7g/L左右,而发酵罐培养过程中的菌体干重最高可以达到7.074g/L,有了大幅度的提高。在F.lignosus的锰过氧化物酶分离纯化过程中,粗酶液经过超浓缩及10%饱和度的聚乙二醇分级分离沉淀后,又经DEAE-cellulose DE52离子交换层析和SephadexTM G-75凝胶过滤层析分析后,可以确定至少有两种锰过氧化物酶存在,分别命名为MnPⅠ、MnPⅡ。纯化后回收率分别为2.4%和3.6%,测定两锰过氧化物酶的分子量分别为46.26kDa和44.41kDa。在酶学性质方面MnPⅠ和MnPⅡ相似,最适温度都为35℃,对热的稳定性也都在20～40℃。最适pH值为4.5,而对pH值的稳定性两种酶稍有差异,MnPⅠ在pH5.0以下比较稳定,MnPⅡ在pH5.5以下比较稳定。酶的动力学测试以2,6-二甲氧基酚为酶促反应底物测得MnPⅠ和MnPⅡ的米氏常数分别为41.3μmol/L和32.7μmol/L。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
1 绪论  9-26
  1.1 木质素的概述  9-10
  1.2 木质素降解菌  10-11
  1.3 参与木质素降解的酶  11-14
    1.3.1 木质素过氧化物酶的催化作用  12-13
    1.3.2 锰过氧化物酶的催化作用  13-14
    1.3.3 种木质素降解酶的协同作用  14
  1.4 锰过氧化物酶的研究现状  14-20
    1.4.1 锰过氧化物酶的结构  14-15
    1.4.2 锰过氧化物酶的作用机制  15-17
    1.4.3 锰过氧化物酶的理化性质  17-18
    1.4.4 锰过氧化物酶的测定方法  18-19
    1.4.5 锰过氧化物酶的基因及表达  19-20
  1.5 应用前景  20-26
    1.5.1 造纸工业  20-22
    1.5.2 环境保护  22-25
    1.5.3 褐煤的生物降解  25-26
2 木质层孔菌产锰过氧化物酶培养体系的优化  26-33
  2.1 引言  26
  2.2 材料与方法  26-27
    2.2.1 菌种  26
    2.2.2 培养基  26-27
    2.2.3 实验试剂  27
    2.2.4 主要仪器设备  27
    2.2.5 实验方法  27
  2.3 实验结果  27-32
    2.3.1 基本产酶曲线  27-28
    2.3.2 单因素实验  28-30
    2.3.3 多因素实验  30-32
  2.4 讨论  32-33
3 木质层孔菌产锰过氧化物酶的发酵罐补料分批发酵  33-40
  3.1 引言  33
  3.2 材料与方法  33-35
    3.2.1 菌种  33
    3.2.2 培养基  33
    3.2.3 实验试剂  33-34
    3.2.4 主要仪器设备  34
    3.2.5 实验方法  34-35
  3.3 实验结果  35-39
    3.3.1 还原糖标准曲线  35
    3.3.2 pH值还原糖曲线  35-36
    3.3.3 补料培养过程曲线  36-39
  3.4 讨论  39-40
4 锰过氧化物酶(MnP)的分离纯化及酶性质的研究  40-55
  4.1 MnP的纯化  40-49
    4.1.1 实验试剂  40
    4.1.2 主要仪器设备  40-41
    4.1.3 实验方法  41-44
    4.1.4 实验结果  44-49
  4.2 锰过氧化物酶的部分酶学性质研究  49-54
    4.2.1 实验方法  49-50
    4.2.2 实验结果  50-54
  4.3 讨论  54-55
结论与展望  55-58
  1 结论  55-56
  2 创新点  56-57
  3 展望  57-58
参考文献  58-68
附录A  68-69
致谢  69

木质层孔菌产MnP培养体系优化及酶学性质研究

内容摘要

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