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一种重组荞麦胰蛋白酶抑制剂的纯化及特性

作　者: 李晨
导　师: 张政；王转花
学　校: 山西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 重组荞麦胰蛋白酶抑制剂纯化性质定点突变活性位点
分类号: S517
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

蛋白酶抑制剂(Proteinase inhibitor,PI)是一类对蛋白酶活性有抑制作用的蛋白质。这类蛋白质普遍存在于动物、植物和微生物中,是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一。根据它们作用于酶的类型,分为丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中,因丝氨酸蛋白酶抑制剂分布广泛,种类繁多,在蛋白质一级结构、作用机理、氨基酸组成以及生物活性等方面有较为深入的研究。胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor,TI)泛指具有抑制胰蛋白酶活性的一类物质,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂。TI分子量一般比较小,作用机制清楚,是研究蛋白质构效关系的合适材料。人们对来自大豆、豇豆、水稻、马铃薯等植物中的胰蛋白酶抑制剂研究得较为广泛,对荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat Tryspin inhibitor,BTI)的研究则比较少。荞麦(Fagopyrum esculentum Moench.)在世界上一些国家和高寒地区都有种植,在某些地区还被作为主要粮食作物。由于其风味独特,籽实中的蛋白质含量高,含有多种氨基酸,营养丰富,尤其是保健和药用功能显著,日益受到人们的关注。但也有报道表明荞麦食品在人体和动物中不易吸收,较难消化。对其内在成分分析发现,蛋白酶抑制剂作为一种抗营养因子,可以抑制蛋白酶的活性,从而限制了体内氨基酸的正常吸收和利用。另外在体外研究发现,苦荞胰蛋白酶抑制剂能够显著抑制HL-60白血病细胞的增殖,而对正常细胞毒性较小。由以上研究可以发现,BTI是一种重要的有功能的活性蛋白,进一步研究其理化性质非常重要。我们先前的研究表明养麦籽实中的TI含量较少,经分离纯化后的产量难以满足研究及应用。为了开展BTI的系统研究并揭示其作用的机理,本实验将已构建的重组质粒pQE31-BTI在大肠杆菌M15中大量表达,获得了重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(Recombinant buckwheat trypsin inhibitor,rBTI)。经过亲和层析和凝胶过滤层析纯化得到高纯度的rBTI。通过理化性质分析表明,重组荞麦胰蛋白酶抑制剂与天然荞麦胰蛋白酶抑制剂的性质类似。用MALDI-TOF-MS分析测出rBTI的相对分子质量为9322.1

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-14
第一章文献综述  14-32
  1 蛋白酶抑制剂概述  14-17
    1.1 蛋白酶抑制剂的类型  14-15
    1.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构及抑制作用机理  15-17
  2 胰蛋白酶抑制剂的研究与应用  17-22
    2.1 大豆胰蛋白酶抑制剂类型  18-19
    2.2 胰蛋白酶抑制剂结构与功能的关系研究  19-20
    2.3 胰蛋白酶抑制剂的应用  20-22
  3 荞麦胰蛋白酶抑制剂  22-26
    3.1 荞麦胰蛋白酶抑制剂的理化性质  23-24
    3.2 荞麦胰蛋白酶抑制剂的研究现状  24-26
  参考文献  26-32
第二章 rBTI的分离纯化及性质分析  32-49
  1 试剂与仪器  32-33
  2 方法  33-36
    2.1 rBTI的分离纯化  33-34
    2.2 rBTI的性质分析  34-36
  3 结果与讨论  36-46
    3.1 rBTI的分离纯化  36-39
    3.2 Western blot鉴定  39
    3.3 胰蛋白酶抑制活性的测定  39-40
    3.4 相对分子质量的测定  40
    3.5 等电点的测定  40
    3.6 酸碱稳定性测定  40-42
    3.7 热稳定性测定  42
    3.8 动力学特征  42-45
    3.9 rBTI的内源荧光光谱  45-46
  4 小结  46-47
  参考文献  47-49
第三章运用定点突变法确定rBTI活性位点  49-58
  1 材料  49-50
    1.1 菌株与质粒  49
    1.2 主要的工具酶及试剂  49
    1.3 寡聚核苷酸  49-50
    1.4 主要试剂的配制  50
    1.5 主要实验仪器  50
  2 方法  50-54
    2.1 pQE31-mBTI原核表达载体的构建  50-54
    2.2 mBTI的表达、纯化及抑制活性分析  54
  3 结果  54-57
    3.1 pQE31-mBTI原核表达载体的构建  54-55
    3.2 mBTI的表达、纯化及抑制活性分析  55-57
    3.3 分析与讨论  57
  参考文献  57-58
第四章小结与展望  58-59
附录  59-60
致谢  60-61
承诺书  61

一种重组荞麦胰蛋白酶抑制剂的纯化及特性

内容摘要

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