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产低温蛋白酶菌株的分离鉴定及其酶的提纯与特性研究
作 者: 刘静
导 师: 闵航
学 校: 浙江大学
专 业: 微生物学
关键词: 低温蛋白酶 金黄杆菌 分离鉴定 紫外诱变 粗酶提纯 纯酶性质
分类号: TQ920.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2005年
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内容摘要
本论文从土壤中分离筛选出一株产低温蛋白酶的菌株HL221,并进行了菌株鉴定、诱变提高酶活、发酵条件优化、粗酶的提纯和酶学特质的研究。结果如下:1.菌株的分离筛选及鉴定 经过富集培养和分离纯化,获得了产低温蛋白酶的菌株HL221。经形态学观察、生理生化特征研究及16S rDNA序列比对结果表明该菌属于金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.)菌株。2.紫外线诱变提高酶活 通过不同时间紫外照射进行菌种诱变,结果表明30s照射时间下,菌株产酶效果最佳,酶活由原出发菌株的110U/mL提高到230U/mL。3.发酵条件优化 通过单因子试验和正交试验,在摇瓶条件下对菌株的碳源、氮源、金属离子、培养温度、pH、接种量等产酶条件进行了优化。得到了菌株的最适产酶条件(g.L-1)为:葡萄糖30,蛋白胨15,Mn2+0.4,Tween80 0.1,K2HPO4 7,KH2PO43,培养温度25℃,培养基初始pH 7,接种量为2%-4%。在此优化条件下酶活可达到305.9U/mL。4.低温蛋白酶粗酶的提纯 粗酶液通过硫酸铵沉淀、G-75和DEAE Sepharose F.F.柱层析从发酵液分离纯化得到纯酶,经过纯化后的蛋白酶比活力达到6076.9U/mg,提纯倍数为27.2,得率为16.0%。5.低温蛋白酶纯酶特性 测得低温蛋白酶纯酶分子量为35 000Da,等电点为4.9。酶促反应最适温度25℃、最适pH为7。酶活在低于25℃、pH7~10范围内稳定,蛋白酶对酪蛋白的Km为3.1mg/mL。
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全文目录
摘要 7-8 ABSTRACT 8-10 文献综述 10-18 1 低温蛋白酶与低温微生物 10 2 低温微生物 10-14 2.1 低温微生物的分布及类群 10-11 2.2 低温微生物冷适应机制 11-13 2.2.1 调节膜脂组成 12 2.2.2 合成冷休克蛋白 12 2.2.3 独特的蛋白质结构 12-13 2.3 低温微生物的应用及前景 13-14 3 低温蛋白酶 14-17 3.1 低温蛋白酶的生理生化特征 14-15 3.2 低温酶冷适应机制 15-16 3.3 低温蛋白酶研究方法 16 3.4 低温蛋白酶的应用 16-17 4 本研究的目的及内容 17-18 第一章 产低温蛋白酶菌株的分离与鉴定 18-26 1 材料 18-19 1.1 样品及菌株分离 18 1.2 主要仪器 18 1.3 培养基 18 1.4 试剂 18-19 2. 方法 19-20 2.1 产蛋白酶菌株富集分离 19 2.2 复筛 19 2.3 蛋白酶粗酶活力测定 19 2.4 G+C mol%含量测定 19 2.5 16S rDNA的PCR扩增和测序 19-20 2.6 系统发育分析 20 2.7 常规分类鉴定 20 3. 结果与讨论 20-26 3.1 菌株筛选 20 3.1.1 初筛 20 3.1.2 菌种的复筛 20 3.2 分离菌株的鉴定 20-26 3.2.1 形态特征及培养特征 20-21 3.2.2 耐药性、耐盐度、温度、pH 21 3.2.3 其他生理生化特性 21-23 3.2.4 菌株对95种碳源利用测定 23-24 3.2.5 菌株的系统发育分析 24-26 第二章 紫外线诱变菌株提高酶量的研究 26-30 1 材料与方法 26-27 1.1 培养基 26 1.2 诱变处理 26-27 1.2.1 菌悬液的制备 26-27 1.2.2 紫外诱变处理 27 1.2.3 菌株筛选 27 1.3 蛋白酶的活性测定 27 2. 结果与讨论 27-30 2.1 菌株选育 27 2.2 诱变对菌种的影响 27-29 2.3 诱变菌株的产酶稳定性测定 29-30 第三章 菌株HL221产酶条件的优化 30-37 1 材料与方法 30 1.1 培养基 30 1.2 生长量的测定 30 2 结果与分析 30-37 2.1 培养条件对菌株生长和产酶的影响 30-32 2.1.1 产酶时间的优化 30-31 2.1.2 培养温度的优化 31 2.1.3 培养基pH的优化 31-32 2.1.4 接种量的优化 32 2.2 发酵培养基组成对菌株产酶的影响 32-34 2.2.1 碳源的优化 32 2.2.2 氮源的优化 32-33 2.2.3 金属离子对产酶的影响 33-34 2.3 条件优化的正交试验 34 2.4 粗酶特性 34-37 2.4.1 温度对粗酶酶活的影响 34-36 2.4.2 pH对粗酶酶活的影响 36-37 第四章 低温蛋白酶的纯化与特性研究 37-45 1 材料与方法 37-38 1.1 菌种 37 1.2 试剂和仪器 37 1.3 酶的分离纯化步骤 37 1.4 蛋白质含量的测定 37 1.5 电泳分析 37-38 1.6 凝胶电泳分析蛋白酶活性 38 2. 结果与分析 38-45 2.1 酶的提纯 38-41 2.1.1 粗酶液制备 38 2.1.2 (NH_4)_2SO_4分级沉淀 38-39 2.1.3 Sephadex G-75分子筛层析 39 2.1.4 DEAE Sepharose Fast Flow柱层析 39 2.1.5 提纯结果 39-41 2.2 酶学性质 41-43 2.2.1 蛋白酶的分子量和等电点的测定 41 2.2.2 最适温度和热稳定性 41 2.2.3 最适pH和对pH的稳定性 41-42 2.2.4 金属离子对酶活的影响 42-43 2.2.5 底物浓度对蛋白酶水解速度的影响——Km的测定 43 2.3 凝胶电泳分析蛋白酶活性 43-45 第五章 结论与展望 45-47 1 研究结论 45 2 展望 45-47 参考文献 47-51
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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 一般性问题 > 基础理论
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