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产低温蛋白酶菌株的分离鉴定及其酶的提纯与特性研究

作 者: 刘静
导 师: 闵航
学 校: 浙江大学
专 业: 微生物学
关键词: 低温蛋白酶 金黄杆菌 分离鉴定 紫外诱变 粗酶提纯 纯酶性质
分类号: TQ920.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2005年
下 载: 466次
引 用: 7次
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内容摘要


本论文从土壤中分离筛选出一株产低温蛋白酶的菌株HL221,并进行了菌株鉴定、诱变提高酶活、发酵条件优化、粗酶的提纯和酶学特质的研究。结果如下:1.菌株的分离筛选及鉴定 经过富集培养和分离纯化,获得了产低温蛋白酶的菌株HL221。经形态学观察、生理生化特征研究及16S rDNA序列比对结果表明该菌属于金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.)菌株。2.紫外线诱变提高酶活 通过不同时间紫外照射进行菌种诱变,结果表明30s照射时间下,菌株产酶效果最佳,酶活由原出发菌株的110U/mL提高到230U/mL。3.发酵条件优化 通过单因子试验和正交试验,在摇瓶条件下对菌株的碳源、氮源、金属离子、培养温度、pH、接种量等产酶条件进行了优化。得到了菌株的最适产酶条件(g.L-1)为:葡萄糖30,蛋白胨15,Mn2+0.4,Tween80 0.1,K2HPO4 7,KH2PO43,培养温度25℃,培养基初始pH 7,接种量为2%-4%。在此优化条件下酶活可达到305.9U/mL。4.低温蛋白酶粗酶的提纯 粗酶液通过硫酸铵沉淀、G-75和DEAE Sepharose F.F.柱层析从发酵液分离纯化得到纯酶,经过纯化后的蛋白酶比活力达到6076.9U/mg,提纯倍数为27.2,得率为16.0%。5.低温蛋白酶纯酶特性 测得低温蛋白酶纯酶分子量为35 000Da,等电点为4.9。酶促反应最适温度25℃、最适pH为7。酶活在低于25℃、pH7~10范围内稳定,蛋白酶对酪蛋白的Km为3.1mg/mL。

全文目录


摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
文献综述  10-18
  1 低温蛋白酶与低温微生物  10
  2 低温微生物  10-14
    2.1 低温微生物的分布及类群  10-11
    2.2 低温微生物冷适应机制  11-13
      2.2.1 调节膜脂组成  12
      2.2.2 合成冷休克蛋白  12
      2.2.3 独特的蛋白质结构  12-13
    2.3 低温微生物的应用及前景  13-14
  3 低温蛋白酶  14-17
    3.1 低温蛋白酶的生理生化特征  14-15
    3.2 低温酶冷适应机制  15-16
    3.3 低温蛋白酶研究方法  16
    3.4 低温蛋白酶的应用  16-17
  4 本研究的目的及内容  17-18
第一章 产低温蛋白酶菌株的分离与鉴定  18-26
  1 材料  18-19
    1.1 样品及菌株分离  18
    1.2 主要仪器  18
    1.3 培养基  18
    1.4 试剂  18-19
  2. 方法  19-20
    2.1 产蛋白酶菌株富集分离  19
    2.2 复筛  19
    2.3 蛋白酶粗酶活力测定  19
    2.4 G+C mol%含量测定  19
    2.5 16S rDNA的PCR扩增和测序  19-20
    2.6 系统发育分析  20
    2.7 常规分类鉴定  20
  3. 结果与讨论  20-26
    3.1 菌株筛选  20
      3.1.1 初筛  20
      3.1.2 菌种的复筛  20
    3.2 分离菌株的鉴定  20-26
      3.2.1 形态特征及培养特征  20-21
      3.2.2 耐药性、耐盐度、温度、pH  21
      3.2.3 其他生理生化特性  21-23
      3.2.4 菌株对95种碳源利用测定  23-24
      3.2.5 菌株的系统发育分析  24-26
第二章 紫外线诱变菌株提高酶量的研究  26-30
  1 材料与方法  26-27
    1.1 培养基  26
    1.2 诱变处理  26-27
      1.2.1 菌悬液的制备  26-27
      1.2.2 紫外诱变处理  27
      1.2.3 菌株筛选  27
    1.3 蛋白酶的活性测定  27
  2. 结果与讨论  27-30
    2.1 菌株选育  27
    2.2 诱变对菌种的影响  27-29
    2.3 诱变菌株的产酶稳定性测定  29-30
第三章 菌株HL221产酶条件的优化  30-37
  1 材料与方法  30
    1.1 培养基  30
    1.2 生长量的测定  30
  2 结果与分析  30-37
    2.1 培养条件对菌株生长和产酶的影响  30-32
      2.1.1 产酶时间的优化  30-31
      2.1.2 培养温度的优化  31
      2.1.3 培养基pH的优化  31-32
      2.1.4 接种量的优化  32
    2.2 发酵培养基组成对菌株产酶的影响  32-34
      2.2.1 碳源的优化  32
      2.2.2 氮源的优化  32-33
      2.2.3 金属离子对产酶的影响  33-34
    2.3 条件优化的正交试验  34
    2.4 粗酶特性  34-37
      2.4.1 温度对粗酶酶活的影响  34-36
      2.4.2 pH对粗酶酶活的影响  36-37
第四章 低温蛋白酶的纯化与特性研究  37-45
  1 材料与方法  37-38
    1.1 菌种  37
    1.2 试剂和仪器  37
    1.3 酶的分离纯化步骤  37
    1.4 蛋白质含量的测定  37
    1.5 电泳分析  37-38
    1.6 凝胶电泳分析蛋白酶活性  38
  2. 结果与分析  38-45
    2.1 酶的提纯  38-41
      2.1.1 粗酶液制备  38
      2.1.2 (NH_4)_2SO_4分级沉淀  38-39
      2.1.3 Sephadex G-75分子筛层析  39
      2.1.4 DEAE Sepharose Fast Flow柱层析  39
      2.1.5 提纯结果  39-41
    2.2 酶学性质  41-43
      2.2.1 蛋白酶的分子量和等电点的测定  41
      2.2.2 最适温度和热稳定性  41
      2.2.3 最适pH和对pH的稳定性  41-42
      2.2.4 金属离子对酶活的影响  42-43
      2.2.5 底物浓度对蛋白酶水解速度的影响——Km的测定  43
    2.3 凝胶电泳分析蛋白酶活性  43-45
第五章 结论与展望  45-47
  1 研究结论  45
  2 展望  45-47
参考文献  47-51

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 一般性问题 > 基础理论
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