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中国沿海有毒亚历山大藻种群识别与计数方法研究

作　者: 唐祥海
导　师: 周名江；于仁成
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 有害赤潮亚历山大藻遗传探针 rRNA rDNA 荧光原位杂交
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

本研究分析了8株分离自中国南海及东海的亚历山大藻的部分核糖体DNA序列信息,其中包括核糖体大亚基(LSU)rDNA 的 5’端 D1-D2 区序列,以及 5.8S rDNA 和 ITS 区序列;同时,也对实验室保种的部分来自其它国家和地区的亚历山大藻相关序列信息进行了分析,以此作为遗传序列分析的质量控制。在此基础上,针对在中国沿海分布的有毒亚历山大藻,根据其核糖体大亚基 DNA(LSU rDNA)序列信息,设计了特异性的荧光标记探针,建立了基于荧光原位杂交技术的有毒亚历山大藻检测方法,并尝试了利用流式细胞仪进行计数的工作。通过 Clustal X 及 MEGA2 软件对所得到的序列信息进行了综合分析与对比。结果表明,对于分离自中国南海的 5 株塔玛亚历山大藻(A. tamarense)和分离自东海的 1 株链状亚历山大藻(A. catenella),即便是在 ITS 区和 LSU rDNA 等高变区,其序列信息也完全一致。与基因库中搜索到的其它亚历山大藻 rDNA 序列信息相比较,中国沿海的亚历山大藻序列更接近于 A. catenella。对于分离自中国南海的另外 2 株未命名的亚历山大藻,通过对比遗传序列信息,发现它们与 A. affine 非常接近。分离于我国台湾的微小亚历山大藻(A. minutum)在遗传序列信息上与分离自新西兰的藻株(Anakoha bay isolate)相似,而与分离自欧洲的藻株(LAC27 或181NT)相差较大。荧光原位杂交实验的结果显示:我们设计的探针 SPEC-PROBE2 可以非常理想地标记选定的目标藻-链状亚历山大藻(ACDH 藻株)。经探针 SPEC-PROBE2标记的有毒藻细胞可以通过荧光显微镜和流式细胞仪很好的区分于其他非目标藻的藻细胞。有毒亚历山大藻的荧光原位杂交检测方法的建立将有助于提高海水样品中有毒亚历山大藻监测的准确性和工作效率。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
文中表目录  7-9
文中图目录  9-11
第一章引言  11-21
  1.1 有毒赤潮研究的重要性与必要性  11-16
    1.1.1 赤潮简介  11-12
    1.1.2 有毒赤潮与藻毒素  12-16
    1.1.3 有毒赤潮的危害效应  16
  1.2 分子生物学技术在有毒赤潮研究与监测中的应用  16-21
    1.2.1 有毒赤潮特征及其相关研究对新技术的需求  17
    1.2.2 分子生物学技术在有毒藻分类、种系进化及藻种监测中的应用  17-21
第二章文献综述  21-37
  2.1 亚历山大藻形态及生物化学鉴定  21-22
  2.2 亚历山大藻的分子生物学鉴定  22-32
    2.2.1 SSU rDNA 分子扩增产物的“A／B 限制位点检测”  23-28
    2.2.2 LSU rDNA 部分序列分析  28-29
    2.2.3 5.8S rDNA 及内转录间隔区RFLP 分析  29-30
    2.2.4 5.8S rDNA 及内转录间隔区序列分析  30
    2.2.5 rDNA 分子的多样性问题  30-31
    2.2.6 A. tamarense／fundyense／catenella 复合种分子进化的“单源辐射”假说及其散布  31-32
  2.3 藻种识别与检测技术  32-34
  2.4 小结  34-37
第三章中国沿海亚历山大藻藻种的分子鉴定  37-51
  3.1 实验材料与方法  37-41
    3.1.1 实验藻株及培养条件  37-38
    3.1.2 DNA 制备及rDNA 靶序列扩增  38-40
    3.1.3 PCR 扩增产物的序列测定及分析  40-41
  3.2 实验结果  41-45
    3.2.1 rDNA 两个高变区的PCR 扩增  41-42
    3.2.2 中国沿海亚历山大藻序列测定结果及遗传距离分析  42-45
    3.2.3 亚历山大藻属系统发育树的构建  45
  3.3 讨论  45-49
    3.3.1 核糖体DNA 用于亚历山大藻分类及种系进化研究的有效性  45-48
    3.3.2 A. tamarense／fundyense／catenella 复合种的分子进化及散布  48-49
  3.4 小结  49-51
第四章应用荧光原位杂交技术检测中国沿海的有毒亚历山大藻  51-63
  4.1 实验材料与方法  52-55
    4.1.1 实验藻株及培养条件  52-53
    4.1.2 探针设计与合成  53-54
    4.1.3 荧光原位杂交方法  54-55
    4.1.4 流式细胞仪检测方法  55
  4.2 实验结果  55-61
    4.2.1 荧光显微镜检测结果  55-60
    4.2.2 流式细胞仪检测结果  60-61
  4.3 讨论  61-62
    4.3.1 荧光原位杂交检测方法的建立  61
    4.3.2 我国沿海有毒亚历山大藻的检测  61-62
  4.4 小结  62-63
结论  63-65
参考文献  65-72
附录  72-73
发表和完成文章目录  73-74
致谢  74

中国沿海有毒亚历山大藻种群识别与计数方法研究

内容摘要

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