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新型生物材料3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯（PHBHHx）的高效发酵生产

作　者: 欧阳少平
导　师: 陈国强
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: 3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯（PHBHHx） 单体组成 高密度培养 透明颤菌血红蛋白基因（vgb）
分类号: TQ921
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯（PHBHHx）因其优异的材料性能及生物相容性而成为生物聚酯家族中最具应用前景的新型生物可降解材料，其材料性能与3-羟基己酸单体(3HHx)在聚酯中的含量相关。本文在嗜水性气单孢菌Aeromonas hydrophila 4AK4发酵生产PHBHHx的过程中发现，培养基中添加4 g L-1的丁醇能使PHBHHx中3HHx单体的组成比例由原来的14.4 mol%降低为5.8 mol%。引入了编码β-酮基硫解酶的phbA基因和编码乙酰乙酰辅酶A还原酶的phbB基因之后，利用葡萄糖酸钠和月桂酸作为混合碳源，对该重组菌Aeromonas hydrophila 4AK4(pTG01)进行了摇瓶培养及6升发酵罐培养的研究，发现可以通过改变碳源中两种组分的比例，在一定范围内自由调控PHBHHx单体组成，使细菌合成的PHBHHx中的3HHx含量由原来的15 mol%左右降低到3-12 mol%。对发酵培养基的进一步优化发现限磷这一营养限制手段能提高PHBHHx的含量。本文在上述研究的基础上，在Aeromonas hydrophila 4AK4中引入了phbA、phbB和编码透明颤菌血红蛋白的vgb基因。该重组菌同样具有可控调节PHBHHx单体组成的能力，并且由于vgb基因的引入，获得了生长快速、可高密度培养等新特性。在摇瓶培养中，当以1:1的月桂酸和葡萄糖酸钠为碳源时，该重组菌4AK4(pVGAB)在48小时内获得了20.5 g L-1的细胞干重（DCW）和49.6 wt%的PHBHHx含量，PHBHHx的产率与同样条件培养的野生型4AK4及4AK4(pTG01)相比，分别提高了148.5 %和85.7 %。在6 L发酵罐中，当以1:1的月桂酸和葡萄糖酸钠为碳源时，42 h发酵罐培养能获得38.4 g L-1 DCW，PHBHHx含量及3HHx组成分别为52 wt%和7.4 mol%；当仅以月桂酸为碳源时，36 h培养能获得54.0 g L-1 DCW，PHBHHx含量及3HHx组成分别为52.7 wt%和12.4 mol%。对培养过程中重组菌质粒稳定性的研究发现，vgb的表达有助于质粒的稳定。

全文目录


第1章 前言  9-24
  1.1 聚羟基脂肪酸酯(PHA)简介  9-14
    1.1.1 PHA结构  9-10
    1.1.2 PHA生物合成代谢途径以及相关基因  10-13
    1.1.3 PHA应用领域  13-14
  1.2 新型PHA-3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯(PHBHHx)  14-19
    1.2.1 PHBHHx优秀的材料性能及生物相容性  14-16
    1.2.2 PHBHHx生物合成与生产  16-17
    1.2.3 嗜水气单胞菌生产PHBHHx研究现状及展望  17-19
  1.3 透明颤菌血红蛋白基因及其在PHA生产中的应用  19-22
    1.3.1 透明颤菌血红蛋白基因(vgb)简介  19-20
    1.3.2 vgb基因在高密度发酵中的应用  20-22
  1.4 论文的目的及意义  22-24
第2章 材料与方法  24-38
  2.1 主要试剂、原料及仪器  24-26
    2.1.1 主要试剂、原料  24-25
    2.1.2 仪器  25-26
  2.2 菌种与质粒  26
  2.3 细菌培养基及培养方法  26-28
    2.3.1 种子培养  26-27
    2.3.2 摇瓶培养  27-28
    2.3.3 发酵罐培养  28
  2.4 理化分析  28-30
    2.4.1 细胞干重分析  28
    2.4.2 PHBHHx含量及单体组成分析  28-29
    2.4.3 氮及磷含量分析  29-30
  2.5 透明颤菌血红蛋白酶活测定  30-32
  2.6 分子生物学实验操作  32-38
    2.6.1 质粒的快速提取  32-33
    2.6.2 DNA片断的酶切、回收及凝胶电泳  33-34
    2.6.3 目的片断的PCR扩增  34-35
    2.6.4 载体与目的片断的连接  35
    2.6.5 大肠杆菌感受态的制备  35-36
    2.6.6 电转化方法及接合方法引入外源质粒  36-37
    2.6.7 质粒稳定性的测量  37-38
第3章 结果及讨论  38-62
  3.1 培养基中添加丁醇改变嗜水气单胞菌合成PHBHHx的单体组成  38-41
  3.2 单体可控PHBHHx的生物合成  41-49
    3.2.1 含有phbA、phbB基因的质粒pTG01的构建  42-43
    3.2.2 重组Aeromonas hydrophila 4AK4 (pTG01)的构建  43
    3.2.3 Aeromonas hydrophila 4AK4 (pTG01)摇瓶实验  43-44
    3.2.4 Aeromonas hydrophila 4AK4 (pTG01)的发酵罐实验  44-47
    3.2.5 限磷对Aeromonas hydrophila 4AK4 (pTG01)合成PHBHHx的影响  47-49
  3.3 高密度培养生产PHBHHx研究  49-62
    3.3.1 含有phbA、phbB及vgb基因的质粒pVGAB的构建  49-50
    3.3.2 重组Aeromonas hydrophila 4AK4 (pVGAB)的构建  50-51
    3.3.3 vgb基因在重组Aeromonas hydrophila 4AK4 (pVGAB)中成功表达  51
    3.3.4 优化摇瓶培养基及培养方法提高vgb的表达  51-55
    3.3.5 vgb的表达促进细菌生长及PHBHHx合成  55-58
    3.3.6 vgb的表达提高了质粒的稳定性  58-62
结论  62-64
参考文献  64-71
致谢、声明  71-72
个人简历、在学期间的研究成果及发表的学术论文  72

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制有机酸
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