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大豆异黄酮开环菌株及其代谢产物的分离鉴定与活性研究

作　者: 于飞
导　师: 王秀伶
学　校: 河北农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 大豆异黄酮菌株分离微生物转化去氧甲基安哥拉紫檀素
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

大豆异黄酮是大豆在其生长过程中形成的次生代谢产物,主要包括:黄豆苷原(daidzein)和染料木素(genistein)。摄入动物体内的大豆异黄酮,在胃肠道微生物作用下被代谢为不同代谢产物,其中黄豆苷原最终被降解为雌马酚(equol)和去氧甲基安哥拉紫檀素(O-desmethylangolensin,简称O-Dma)。人群中大约80%~90%的个体,其肠道微生物能将摄入体内的黄豆苷原转化为O-Dma。以前大多数人认为O-Dma的活性很低,但最近有报道称O-Dma不仅与人体雌激素受体ERα和ERβ的亲和力高于其前体黄豆苷原,而且与ERβ结合后,在诱导基因转录上O-Dma也强于黄豆苷原。此外,当浓度高于10μmol/L,O-Dma能够明显抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长。AUH-HM195(EU919863)菌株是国内外首次从褐马鸡粪样中分离的一株对大豆异黄酮黄豆苷原具有开环转化作用的兼性细菌菌株。该菌株菌落为圆形,光学显微镜下该菌体呈球形或椭球形,根据菌落及菌体形态特征以及糖发酵、触酶、吲哚试验等常规生理生化测定结果,初步确定该菌株为肠球菌属。通过BLAST比对,菌株AUH-HM195的16S rDNA与海氏肠球菌Enterococcus hirae(DSM20160)的序列相似性达到100%。因此,褐马鸡肠道分离菌株AUH-HM195鉴定为海氏肠球菌Enterococcus hirae AUH-HM195。以大豆异黄酮黄豆苷原为底物,以菌株Enterococcus hirae AUH-HM195为生物酶源,采用高效液相方法对底物黄豆苷原代谢产物进行检测。出现两个物质峰,其中一个随着底物的减少逐渐增加,确定为底物的代谢峰。另外一个峰的增加与底物的减少不同步进行,将该峰定为未知峰。根据高效液相色谱保留时间、紫外吸收光谱,以及核磁共振氢谱(1H)和碳谱(13C)等手段将代谢产物最后确定为去氧甲基安哥拉紫檀素(O-Dma)。对O-Dma进行初步抗氧化活性研究,结果表明它具有一定的清除羟自由基与超氧阴离子的能力。由于未知峰性质不稳定,目前尚未完成其结构鉴定,但抑菌试验发现该未知峰对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有较强的抑制作用。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章引言  9-12
  1.1 大豆异黄酮及其生物学功能  9-10
    1.1.1 大豆异黄酮结构与种类  9
    1.1.2 大豆异黄酮的性质  9
    1.1.3 大豆异黄酮的生物学功能  9-10
  1.2 大豆异黄酮转化菌株研究现状  10-11
    1.2.1 大豆异黄酮在哺乳动物体内的代谢  10
    1.2.2 大豆异黄酮转化菌株的分离与筛选  10-11
  1.3 大豆异黄酮代谢产物的生物学功能  11-12
第二章大豆异黄酮开环菌株的分离与鉴定  12-19
  2.1 材料  12-14
    2.1.1 菌株来源  12
    2.1.2 生理生化鉴定培养基  12-13
    2.1.3 药品与试剂  13
    2.1.4 主要试验仪器与设备  13-14
  2.2 试验方法  14-15
    2.2.1 开环菌株的分离筛选  14
    2.2.2 高效液相检测  14
    2.2.3 菌落和菌体形态观察与生理生化特性测定  14
    2.2.4 筛选菌株的DNA 的提取  14-15
    2.2.5 筛选菌株的165 rDNA 的序列分析  15
  2.3 结果与分析  15-18
    2.3.1 菌株AUH-HM195 的菌落特征  16
    2.3.2 菌株AUH-HM195 菌体形态特征  16-17
    2.3.3 菌株AUH-HM195 生理生化特征  17
    2.3.4 菌株AUH-HM195 的165 rDNA 的序列分析  17-18
  2.4 讨论  18-19
第三章大豆异黄酮黄豆苷原代谢产物的分离纯化与结构鉴定  19-25
  3.1 材料  19-20
    3.1.1 菌株  19
    3.1.2 培养基  19
    3.1.3 药品与试剂  19-20
    3.1.4 主要试验仪器与设备  20
  3.2 试验方法  20-21
    3.2.1 代谢产物的分离纯化  20
    3.2.2 代谢产物的鉴定  20
    3.2.3 手性代谢产物的手征性测定  20-21
    3.2.4 转化菌株对黄豆苷原转化动态研究  21
  3.3 结果与分析  21-24
    3.3.1 代谢产物的高效液相色谱分析  21-22
    3.3.2 代谢产物的核磁共振氢谱（1H-NMR）和碳谱（13C-NMR）  22
    3.3.3 O-Dma 的对映体过量率(e.e.%)  22-23
    3.3.4 细菌菌株Enterococcus hirae AUH-HM195 对黄豆苷原的代谢曲线  23-24
  3.4 讨论  24-25
第四章代谢产物去氧甲基安哥拉紫檀素的活性研究  25-29
  4.1 材料  25-26
    4.1.1 供试病原菌  25
    4.1.2 培养基  25
    4.1.3 药品与试剂  25
    4.1.4 主要试验仪器与设备  25-26
  4.2 试验方法  26-27
    4.2.1 抑菌活性的检测  26
    4.2.2 抗氧化活性的检测  26-27
  4.3 结果与分析  27-28
    4.3.1 代谢产物抑细菌的活性检测  27
    4.3.2 代谢产物清除羟自由基(·OH)能力  27
    4.3.3 代谢产物清除超氧阴离子(·02－)能力  27-28
  4.4 讨论  28-29
第五章未知峰初步结构鉴定与活性测定  29-37
  5.1 材料  29-30
    5.1.1 供试病原菌  29
    5.1.2 培养基  29
    5.1.3 药品与试剂  29
    5.1.4 主要试验仪器与设备  29-30
  5.2 试验方法  30-31
    5.2.1 未知峰的分离纯化  30
    5.2.2 未知峰的鉴定  30
    5.2.3 未知峰抑菌活性的检测  30
    5.2.4 未知峰抗氧化活性的研究  30-31
  5.3 结果与分析  31-36
    5.3.1 未知峰高效液相色谱检测  31-32
    5.3.2 未知峰核磁共振氢谱和碳谱  32-33
    5.3.3 未知峰HSQC 谱和~(135)DEPT 谱分析  33-35
    5.3.4 未知峰抑菌活性检测  35-36
    5.3.5 未知峰抗氧化活性检测  36
  5.4 讨论  36-37
结论  37-38
参考文献  38-42
附录  42-44
在读期间发表的学术论文  44-45
作者简历  45-46
致谢  46

大豆异黄酮开环菌株及其代谢产物的分离鉴定与活性研究

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