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DHV-Ⅰ抗体乳胶凝集试剂盒的研制和间接ELISA方法的建立

作　者: 彭婉芬
导　师: 胡薛英
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: Ⅰ型鸭肝炎 乳胶凝集试验 IgY ELISA
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)引起的鸭病毒性肝炎(DVH)是一种高致病性传播迅速的疾病,它已经成为威胁养鸭业的主要疾病之一。DHV-Ⅰ主要感染1月龄以下雏鸭,尤其是2周内的更易感。免疫接种是预防和控制鸭肝炎的主要手段。DHV-Ⅰ疫苗通常是通过注射种鸭使其雏鸭获得被动在免疫。为了适应不同层次的检测需要,本文研究并建立了检测DHV-Ⅰ抗体的LAT和间接ELISA两种方法,以用于监控疫苗的免疫效果,指导制订合理的免疫程序。具体研究成果如下:第一,本研究首先通过鸡胚繁殖DHV-Ⅰ弱毒并进行灭活,然后通过对比4种不同的纯化方法,探索出一种简单有效重复性好且利于大量制备纯化病毒的方法——差速超高速离心法,用以制备检测DHV-Ⅰ抗体的抗原。纯化后的抗原采用磷钨酸负染电镜进行观察、鉴定,结果表明经差速超高速离心后杂蛋白很少,病毒粒子清晰。第二,制备建立检测方法所需的鸭源DHV-Ⅰ阳性与阴性血清,并经中和试验验证所制DHV-Ⅰ阳性血清中和效价为1:32,阴性血清不具有中和作用。第三,将经过纯化灭活后的病毒,作为包被抗原,建立了一种检测鸭血清中抗体的间接ELISA方法。通过对反应条件优化,确定了各组分的最适工作条件为:抗原包被浓度为1:800(5.56μg/mL),样品稀释浓度为1:256,二抗稀释浓度为1:3200,阴阳性临界值为0.249。通过对本方法的评估及对1058份样品的检测结果表明,本试验建立的间接ELISA方法可用于鸭血清中DHV-Ⅰ抗体的实验室检测。第四,将经过纯化灭活的病毒用于致敏聚苯乙烯乳胶,建立了检测DHV-Ⅰ抗体的LAT方法。经过对该LAT进行优化,确定的最佳致敏条件为:致敏温度37℃,病毒致敏量300μg/mL,致敏时间2.5h。通过对本方法的评估及对1058份样品的检测结果表明,本试验建立的LAT方法可用于血清中DHV-Ⅰ抗体水平的临床检测,并通过试验初步确定其临床决定水平为“+++”。第五,为了进一步评估该LAT和间接ELISA方法,将两者进行了一系列的对比试验。首先,应用LAT、问接ELISA、与NT对来自20羽免疫了四次DHV-Ⅰ的鸭血清样本进行检测,结果一致符合且表明样本为阳性。其次,使用间接ELISA和LAT分别对30个阴性血清样本和1个阳性血清样本进行检测,结果两者均能正确选择出阳性样本,并均具有较好的选择性。再次,对相同40个血清样本作倍比稀释后进行的检测表明,虽然LAT与ELISA均表明40个样本均为阳性,但是敏感性方面使用Stata软件包进行Kappa检验表明:LAT与ELISA检测结果的Kappa值为-0.012200,这表明两者敏感性的一致性极差,差异显著,且由均值可见ELISA更敏感。最后,通过对相同的1058个血清样本进行独立检测结果表明:与间接ELISA相比,LAT的敏感性为89.1%,特异性92.7%,总符合率为91.4%,Kappa值为0.815200,95%置信区间为[0.754965,0.875435],可见两试验结果一致性极强。第六,本文研究的LAT试剂盒还经过了质量控制试验。该试剂盒批间与批内差异不显著,在4℃条件下保存七个月后,其敏感性、特异性均检测不出变化。此外,盲样检测表明该试剂盒具有很好的潜在应用前景和经济价值。

全文目录


摘要  9-11
ABSTRACT  11-15
前言  15-20
  1 国内外研究进展  15-19
    1.1 病原特性  15-16
    1.2 流行病学与临床症状  16
    1.3 DHV-I清抗体诊断方法现状  16-19
      1.4.1.中和试验  17
      1.4.2.琼脂扩散试验  17
      1.4.3.血凝试验  17
      1.4.4.荧光抗体  17-18
      1.4.5.酶联免疫吸附试验(ELISA)  18
      1.4.6.胶体金标记  18
      1.4.7.分子生物学  18
      1.4.8.乳胶凝集试验  18-19
  2 研究的目的与意义  19-20
材料和方法  20-37
  1 主要仪器设备  20
  2 主要试剂  20
  3 抗原、实验动物、样品  20-21
  4 主要溶液及其配制  21-22
  5 Ⅰ型鸭肝炎弱毒的增殖与纯化  22-24
    5.1 Ⅰ型鸭肝炎弱毒病毒的增殖  22-23
    5.2 Ⅰ型鸭肝炎弱毒病毒的纯化  23-24
      5.2.1.Ⅰ型鸭肝炎弱毒病毒的蔗糖密度梯度离心纯化  23
      5.2.2.Ⅰ型鸭肝炎弱毒病毒的氯仿差速超高速离心纯化  23
      5.2.3.Ⅰ型鸭肝炎弱毒病毒的超滤-差速超高速离心纯化  23
      5.2.4.Ⅰ型鸭肝炎弱毒病毒的差速超高速离心纯化  23-24
    5.3Ⅰ型鸭肝炎弱毒病毒纯度鉴定  24
      5.3.1.电镜观察  24
      5.3.2.将病毒液用核酸蛋白仪进行蛋白含量测定。  24
  6 Ⅰ型鸭肝炎病毒抗体阳性、阴性对照血清的制备  24-27
    6.1 动物准备及分组  24
    6.2 弱毒尿囊液处理  24
    6.3 强毒肝匀浆的制备  24-25
    6.4 免疫程序  25
    6.5 鸭抗DHV-I高免血清中和效价的测定  25
    6.6 鸭抗DHV-I血清的采集及保存  25-26
    6.7 阴性血清制备方法  26
    6.8 AGP检测阳性及阴性血清  26-27
      6.8.1 琼脂板的制备  26
      6.8.2 抗原的制备  26
      6.8.3 AGP最佳样品稀释度选择  26-27
      6.8.4 AGP检测自制阴性血清样本  27
  7 间接ELISA方法的建立  27-30
    7.1 最佳工作浓度的确定及工作条件的优化  27-29
      7.1.1.最佳抗原包被浓度和最佳抗体工作浓度的确定  27
      7.1.2.最佳抗体工作浓度和最佳二抗浓度的确定  27-28
      7.1.3.最佳包被条件的确定  28
      7.1.4.最佳一抗反应时间的确定  28
      7.1.5.最佳酶标二抗反应时间的确定  28
      7.1.6.最佳封闭条件的确定  28
      7.1.7.最佳显色时间的确定  28-29
    7.2 间接ELISA方法的评估  29-30
      7.2.1.临界值测定  29
      7.2.2.选择性试验  29
      7.2.3.符合性、敏感性试验  29
      7.2.4.检测域试验  29-30
      7.2.5.特异性试验  30
      7.2.6.稳定性试验  30
      7.2.7.重复性试验  30
  8 Ⅰ型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测方法的建立  30-34
    8.1 乳胶前处理  31
    8.2 LAT最佳工作浓度的确定及工作条件的优化  31-32
      8.2.1.致敏方法  31
      8.2.2.最佳致敏病毒量的确定  31-32
      8.2.3.最佳致敏时间的选择  32
      8.2.4.最佳致敏温度的选择  32
      8.2.5.致敏加样方式的选择  32
    8.3 LAT方法的评估  32-33
      8.3.1.选择性试验  32-33
      8.3.2.符合性、敏感性试验  33
      8.3.3.特异性试验  33
      8.3.4.检测域试验  33
    8.4 LAT反应体系的确定  33-34
      8.4.1.LAT反应量的确定  33
      8.4.2.LAT反应步骤的确定  33-34
  9 DHV-I抗体乳胶凝集检测试剂盒的组装  34
    9.1 乳胶凝集卡设计及前处理  34
    9.2 组分的确定  34
    9.3 试剂盒外包装的确定  34
  10 DHV-I抗体乳胶凝集检测试剂盒的应用评估和质量控制  34-37
    10.1 LAT试剂盒批内重复性试验  34
    10.2 LAT试剂盒批间重复性试验  34-35
    10.3 高温对试剂盒的破坏作用(37℃下贮存3D)  35
    10.4 试剂盒的保存期试验(4℃)  35
    10.5 DHV-I抗体乳胶凝集检测试剂盒的盲样检测  35
    10.6 DHV-I抗体LAT与ELISA的初步应用的比较  35
    10.7 临床决定水平  35-36
    10.8 试剂盒的使用方法说明  36-37
      10.8.1 样品制备  36
      10.8.2 检测  36
      10.8.3 结果判定  36-37
结果与分析  37-63
  1 Ⅰ型鸭肝炎弱毒的增殖与纯化结果  37-38
  2 鸭抗DHV高免血清中和效价的测定结果  38-40
    2.1 测病毒LD_(50):  38-39
    2.2 中和指数测定:  39-40
  3 AGP检测阳性及阴性血清结果  40-41
    3.1 AGP最佳血清稀释度试验结果  40
    3.2 AGP样本检测结果  40-41
  4 间接ELISA方法的建立  41-49
    4.1 最佳工作浓度的确定及工作条件的优化结果  41-43
      4.1.1.最佳抗原包被浓度和最佳抗体工作浓度的确定  41
      4.1.2.最佳抗体工作浓度和最佳二抗浓度的确定  41-42
      4.1.3.最佳包被条件的确定  42
      4.1.4.最佳一抗反应时间的确定  42-43
      4.1.5.最佳酶标二抗反应时间的确定  43
      4.1.6.最佳封闭条件的选择  43
      4.1.7.最佳显色时间的选择  43
    4.2 间接ELISA方法的评估  43-49
      4.2.1.临界值的确定  43-44
      4.2.2.选择性试验  44
      4.2.3.符合性、敏感性试验  44-45
      4.2.4.检测域试验  45
      4.2.5.特异性试验  45-46
      4.2.6.稳定性试验  46-48
      4.2.7.重复性试验  48-49
  5 DHV-I抗体乳胶凝集检测方法的建立  49-54
    5.1 LAT最佳工作浓度的确定及工作条件的优化结果  49-51
      5.1.1.最佳致敏病毒量的确定  49-50
      5.1.2.最佳致敏时间的选择  50
      5.1.3.最佳致敏温度的选择  50-51
      5.1.4.致敏加样方式的选择  51
    5.2 Ⅰ型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测方法的评估  51-53
      5.2.1.选择性试验  51-52
      5.2.2.符合性、敏感性试验  52-53
      5.2.3.特异性试验  53
      5.2.4.检测域试验  53
    5.3 反应体系试验  53-54
      5.3.1.反应量的确定  53
      5.3.2.反应步骤的确定  53-54
  6 Ⅰ型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测剂盒的组装  54-56
    6.1 乳胶凝集卡设计及前处理  54-55
    6.2 试剂盒组分的确定  55-56
    6.3 试剂盒外包装:  56
  7 DHV-I抗体乳胶凝集检测试剂盒的评诂与质量控制  56-63
    7.1 LAT试剂盒批内重复试验结果  56-58
    7.2 LAT试剂盒批间重复性试验  58
    7.3 高温对本发明试剂盒的破坏作用(37℃下贮存3D)  58-59
    7.4 试剂盒的保存期试验(4℃)  59-60
    7.5 Ⅰ型鸭肝炎病毒抗体乳胶凝集检测试剂盒的盲样检测  60
    7.6 Ⅰ型鸭肝炎病毒LAT与间接ELISA检测结果的比较  60-61
    7.7 临床决定水平的测定  61-63
讨论  63-69
  1 关于DHV-I病毒纯化  63-64
  2 关于所建立的间接ELISA  64-65
  3 关于LAT的致敏  65-66
  4 关于乳胶试验载体的改进  66
  5 关于LAT试剂盒与ELISA方法  66-69
结论  69-70
参考文献  70-77
致谢  77

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学 > 实验室诊断 > 免疫学检验
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