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基因治疗用质粒DNA生产及产物纯化的研究

作　者: 韩依辰
导　师: 吴丛梅
学　校: 长春工业大学
专　业: 有机化学
关键词: 质粒DNA IL-24 发酵培养纯化质量检测
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

大量国内外研究表明IL-24基因具有广谱抗肿瘤活性,对黑色素瘤、子宫颈癌、肺癌、前列腺癌等肿瘤细胞均有抑制作用。因此含有IL-24基因的质粒具有潜在的,临床治疗肿瘤的应用前景。大规模制备、纯化药用级含IL-24基因的质粒DNA是其应用于基因治疗的关键。本论文系统地研究了含有重组质粒pcDNA3.1-IL-24工程菌的构建、发酵、大规模裂解条件,重组质粒pcDNA3.1-IL-24分离纯化路线以及质量检测体系的建立。首先我们将已构建好的重组质粒pcDNA3.1-IL-24转化大肠杆菌E.coli DH5a,构建rh-IL-24工程菌,考察工程菌的传代稳定性后,在BIOFLO 40L发酵罐中,通过补料分批发酵的方式,流加发酵培养液,控制发酵温度在36℃-38℃之间、发酵培养对数生长期溶解氧浓度控制在30%-50%之间,PH保持在7.0左右的发酵参数上罐发酵。16h结束发酵后,收获菌体约为36g湿菌体/L。离心收集菌体,使用碱裂解法大量制备粗制质粒DNA,先通过盐沉淀法粗纯质粒DNA,然后使用离子交换层析、疏水层析、分子筛层析进一步纯化,最后进行无菌超滤,将质粒DNA浓缩到药用剂量后分装到安瓿里保存。依照国家食品药品监督局颁布的《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》,我们建立了相应的检测体系,对质粒DNA产品进行质量鉴定,结果表明,本工艺制备的质粒DNA外观澄清、无杂质；pH值为7.2；质粒DNA浓度为727μg/mL；纯度(OD260/OD280)为1.87；杂质蛋白含量为O.007μg/μg质粒DNA；无RNA和抗生素残留；细菌内毒素小于0.007EU/μg质粒DNA。检测结果符合药用标准。与传统实验室方法相比,本工艺生产流程避免使用有毒试剂(苯酚、氯仿)和动物源性酶类(RNase A),确保了产品的安全性的同时,也减少了检测有毒试剂残余量的繁琐步骤；本工艺使用的大都是价格低廉的国产试剂,所用的材料和设备(凝胶、反应器等)可以反复再生使用。生产周期较短,满足了实际生产需求,具有良好的经济性；此外,本工艺操作简单、易于放大、重复性好,并且建立了相应的质粒DNA质量检测体系,对于药用级质粒DNA大规模制备具有重要的现实意义,也为同类研究的进行奠定了理论基础,为进一步的工业化生产提供了借鉴。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-7
第一章绪论  7-15
  1.1 基因治疗概述  7-8
    1.1.1 基因治疗策略  7
    1.1.2 基因治疗常用载体  7-8
  1.2 IL-24基因概述  8-9
  1.3 基因治疗用质粒DNA生产工艺的研究进展  9-14
    1.3.1 质粒DNA生产策略  9
    1.3.2 细胞裂解  9-10
    1.3.3 澄清和浓缩  10
    1.3.4 色谱纯化质粒的原理及应用特点  10-12
    1.3.5 重组质粒DNA质量监控标准的建立及要求  12-14
  1.4 本课题的来源及研究意义  14-15
第二章实验材料和方法  15-24
  2.1 材料、试剂和仪器  15-18
    2.1.1 实验材料  15-16
    2.1.2 主要仪器  16-17
    2.1.3 常用试剂配制  17-18
  2.2 实验方法  18-24
    2.2.1 rh-IL-24工程菌的构建  18
    2.2.2 菌种传代稳定性的研究  18-19
    2.2.3 工程菌种子库的建立  19
    2.2.4 起始培养基的选择  19-20
    2.2.5 工程菌发酵培养  20
    2.2.6 质粒DNA的制备  20-21
    2.2.7 裂解液澄清  21
    2.2.8 色谱纯化  21
    2.2.9 琼脂糖凝胶电泳  21-22
    2.2.10 质粒DNA定量  22
    2.2.11 细菌内毒素检测  22
    2.2.12 杂质蛋白检测  22
    2.2.13 无菌试验  22-23
    2.2.14 残余抗生素检测  23-24
第三章实验结果  24-36
  3.1 RH-IL-24工程菌的构建  24-26
    3.1.1 rh-IL-24工程菌的鉴定  24
    3.1.2 工程菌传代稳定性的研究  24-25
    3.1.3 基因测序结果  25-26
  3.2 质粒DNA发酵工艺的研究  26-28
    3.2.1 起始培养基的选择  26-27
    3.2.2 菌体发酵生长曲线的绘制  27-28
    3.2.3 发酵时间对质粒DNA浓度的影响  28
  3.3 质粒DNA的色谱纯化工艺  28-31
    3.3.1 DEAE Sepharose FF离子交换层析纯化质粒DNA  29-30
    3.3.2 疏水层析纯化质粒DNA  30-31
    3.3.3 Sepharose 4 FF分子筛层析纯化质粒DNA  31
  3.4 两种质粒DNA纯化方法的比较  31-36
    3.4.1 质粒DNA浓度测定  32
    3.4.2 细菌内毒素含量测定  32
    3.4.3 残留RNA检测  32-33
    3.4.4 杂质蛋白含量检测  33-34
    3.4.5 无菌试验  34
    3.4.6 抗生素残留试验  34-35
    3.4.7 质粒DNA产品外观  35-36
第四章讨论  36-41
  4.1 RH-IL-24工程菌构建及发酵生产的研究  36-37
  4.2 质粒DNA纯化工艺  37-38
  4.3 质粒DNA质量检测平台的建立  38-39
  4.4 两种纯化方法的比较  39-41
结论  41-42
致谢  42-43
参考文献  43-46
附录1 英文缩写表  46-47
攻读硕士学位期间研究成果  47-48

基因治疗用质粒DNA生产及产物纯化的研究

内容摘要

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