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γ-GCS在狼疮性肾炎间质纤维化中的作用研究

作　者: 张北平
导　师: 陶怡
学　校: 广州医学院
专　业: 内科学
关键词: GCS 间质纤维化肾组织损害 GSH 正常小鼠肾小管上皮细胞氧化损害雌性小鼠肾小管间质炎症细胞因子狼疮性肾炎正常对照组脂质过氧化物 fibrosis 成纤维细胞的肾小球系膜细胞转录水平 mRNA 肾小球硬化
分类号: R593.242
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景:狼疮性肾炎是SLE最常见的并发症之一,也是一种常见的继发性肾小球肾炎,以肾小球、肾血管和间质损害为特征,后期可发展为肾小球硬化、纤维性新月体、肾小管萎缩和间质纤维化等,终末期发展为肾间质纤维化,导致肾脏功能衰竭,肾脏病变是影响SLE远期预后的最主要因素;因而对狼疮性肾炎肾间质纤维化的发病机制的研究是治疗SLE的一个重要方面。目前研究认为TGF-β1在肾间质纤维化中具有重要的作用,可刺激肾组织炎症过度修复、肾小管上皮转分化,促进肾小球系膜细胞和内皮细胞增生以及ECM的合成和积聚,促使肾小球硬化和肾间质纤维化。研究表明TGF-β1在LN患者肾小管上皮细胞和间质成纤维细胞的表达明显升高,是LN肾间质纤维化过程中重要的刺激因子。其致纤维化作用通过促进ECM合成和抑制其降解来实现的。纤溶酶原激活剂是一种可以激活纤溶酶原转化成纤溶酶的蛋白酶,保持基质形成和纤溶降解处在一种动态平衡中。纤溶酶原激活物抑制物(Pal-l)是血液中纤溶酶原激活剂最有效的生理性抑制剂,它通过与激活剂结合以抑制纤溶酶原激活。TGF-β1可以有效的刺激Pal-l在肾组织的表达,从而抑制ECM的降解,促成其在肾间质大量沉积,这个过程是由ROS介导完成的。在狼疮性肾炎病理中,免疫损伤联合炎症反应,导致肾组织受到各种氧化因素如一氧化氮、脂质过氧化物等的作用而形成损害,最终发展到肾间质纤维化的不可逆性损害。谷胱甘肽(GSH)是人体内抗氧化机制中的最重要因素之一,在机体内可以有效对抗氧化因子的损害作用。最新报道的SLE病人体内GSH水平显著低于正常对照组,并与疾病活动密切相关,因而肾组织GSH水平是影响肾组织损害发展到肾间质纤维化的一个重要因素;并且GSH还可以通过中和ROS抑制TGF-β-1诱导的Pal-l表达,促使ECM降解。氧化损害等多种刺激可不同程度调节肾组织GSH浓度,其中一个重要的调节环节,就是转录水平调控GSH合成的限速酶—γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS),从而调节细胞内GSH浓度,促进肾组织损伤修复或保护肾组织免受氧化损害。综上可知,在LN患者体内GSH水平降低代表抗氧化能力降低,体循环内各种氧化因素直接对肾组织造成损害,并且介导TGF-β1的致纤维化作用。对LN肾组织GSH转录水平的调控因素γ-GCS的研究,将是对LN肾间质纤维化机制研究的一个新的切入点。研究目的:1.对照正常小鼠,观察狼疮鼠模型MRL/1pr小鼠肾组织纤维化因子TGF-β1转录水平和蛋白水平的表达改变。2.对照正常小鼠观察GSH及其合成限速酶γ-GCS在MRL/1pr小鼠肾组织的表达,评估狼疮鼠肾组织抗氧化能力的改变。探讨MRL/1pr小鼠肾组织GSH及γ-GCS表达改变在肾间质纤维化中的作用。3.构建γ-GCS-pEGFP-c1真核表达质粒,培养原代狼疮小鼠肾小管上皮细胞。为后续性研究γ-GCS在肾小管上皮细胞表达做前期准备。方法:1.分组正常对照组:16周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠;LN模型组:16周龄SPF级MRL/1pr雌性小鼠,各10只。2.组织染色观察肾组织病理。3.用荧光定量PCR方法检测两组小鼠肾组织γ-GCS和纤维化因子TGF-β1的mRNA水平表达改变。4.免疫组织化学法检测TGF-β1蛋白量改变。5.westernbloting检测肾组织γ-GCS蛋白表达量。比色法检测肾组织GSH水平。6.使用PCR方法克隆γ-GCS序列片段,重组到pEGFP-c1真核表达载体,酶消化法培养原代肾小管上皮细胞。7.用SPSS 13.0统计软件进行分析,数据用均数±标准差( x±s)表示,两样本比较用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。结果:1.病理改变光镜下HE染色切片可见,狼疮鼠组部分肾小管上皮细胞萎缩、脱落,管腔扩张,及小管上皮细胞纤维化,局灶性的小管间质纤维化、空泡化,并可见蛋白管型。2.荧光定量PCR结果采用半定量法对比γ-GCS和TGF-β1在C57BL/6和MRL/1pr小鼠的表达差异,狼疮小鼠组肾组织中γ-GCS的mRNA水平与正常小鼠组比较表达减少,TGF-β1的mRNA表达水平升高,差异有统计学意义,(p均<0.05)。狼疮鼠肾组织GSH水平明显下降(p<0.05)。3.免疫组化结果结果显示TGF-β1主要在肾小管上皮细胞胞浆较高表达。MRL/1pr小鼠的肾小管上皮细胞表达高于正常小鼠(p<0.05)。免疫印迹结果证明γ-GCS在狼疮小鼠肾组织蛋白表达降低(p<0.05)。4.成功构建了γ-GCS-pEGFP-c1真核表达载体,测序结果与γ-GCSmRNA基因序列序列一致。成功培养原代肾小管上皮细胞。早期细胞多呈梭形或圆梭形,苏木素染色可观察到细胞核淡蓝染色,为体积较大的多边鹅卵石样。结论:在LN肾组织,炎症刺激的TGF-β1的高表达引起γ-GCS的表达降低,从而使GSH合成减少,LN患者肾组织氧化-抗氧化系统失衡,肾组织产生的大量ROS介导了纤维化因子TGF-β1在肾组织的促纤维化作用,一定程度上加速了肾间质纤维化的进程。该研究为今后狼疮性肾炎的治疗研究提供了新的指导思路,为狼疮性肾炎致病机理的进一步研究奠定了基础。成功构建了γ-GCS-pEGFP-c1真核表达载体和成功培养原代肾小管上皮细胞,为进一步研究γ-GCS在肾间质纤维化的肾小管上皮细胞中的作用,做了前期准备。

全文目录

中英文对照词表  3-5
中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
前言  12-16
第一部分 γ-GCS、TGF-β以及GSH 在MRL/1PR 小鼠肾组织表达研究  16-32
  一实验材料与仪器  16-18
  二实验方法  18-27
  三实验结果  27-29
  四讨论  29-31
  五结论  31-32
第二部分 γ-GCS 真核表达质粒的构建及原代肾小管上皮细胞的培养  32-43
  一实验材料与仪器  32-33
  二实验方法  33-39
  三实验结果  39-40
  四讨论  40-42
  五结论  42-43
参考文献  43-48
附图  48-53
综述  53-62
  参考文献  59-62
致谢  62-63

γ-GCS在狼疮性肾炎间质纤维化中的作用研究

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