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氯化钾诱导硫氧还蛋白和CDK5表达的分子机制

作 者: 李彦辉
导 师: 白洁
学 校: 昆明理工大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: KCl 硫氧还蛋白 细胞周期素依赖性蛋白激酶-5 帕金森病
分类号: R742.5
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要


帕金森氏症(Parkinson’s Disease, PD)是常见的神经退行性疾病,主要临床表现有震颤、僵直、运动减少。病理改变为黑质区的多巴胺神经元进行性慢性坏死。因此保护神经元细胞是治疗该疾病的关键。氯化钾(potassium chloride, KCl)可以使细胞膜去极化,改变细胞膜离子通道通透性,调节质膜和钙库膜上的Ca2+通道,引起细胞内游离Ca2+浓度升高。此外,KCl还具有兴奋细胞,促进神经元存活以及保护神经细胞的作用。硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)是一个分子量为12KDa的多功能蛋白,普遍存在于原核生物和真核生物中。它与NAPDH和硫氧还蛋白还原酶组成细胞内的硫氧还蛋白系统,其具有保守氧化还原活性位点的序列为:-Cys-Gly-Pro-Cys-。它除了具有抗氧化作用外,还有抑制细胞凋亡、调节转录因子活性等作用。很多研究证明Trx与人类疾病密切相关,其中Trx对神经细胞具有保护作用,在神经退行性疾病的发生发展过程发挥重要作用。细胞周期素依赖性蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase 5, CDK5)是脯氨酸依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶。其激动剂P35/P39仅存在于神经系统,故特异性的在神经系统中发挥作用,表现为CDK5对神经细胞具有保护作用。到目前为止,有关KCl诱导Trx、CDK5的表达的研究尚未见报道。我们以大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12为研究对象,探索KCl诱导Trx、CDK5表达及相关机理。结果证明,KCl可以诱导Trx和CDK5的表达增加。另外,我们发现NMDA受体(N-methyl-d-aspartate receptors)抑制剂MK-801, CaMKII (Calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ)抑制剂KN-62以及ERK(extracellular signal-regulated kinase)抑制剂PD98059,可以阻断KC1诱导Trx、CDK5的表达。此外,KCl预刺激后,可以保护神经元免受1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion, MPP+)所致损伤,并且可以回复MPP+引起的Trx和CDK5表达的降低。我们的实验发现KC1去极化对神经细胞保护作用与诱导Trx和CDK5相关,KC1促进细胞生长以及保护细胞免受MPP+所致细胞损伤与NMDA受体、CaMKⅡ、ERK途径有关。综上所述,本研究发现了KCl可以诱导Trx和CDK5表达以及证明了KC1诱导Trx和CDK5表达的相关信号转导通路。并且初步阐明了KCl促进PC12细胞生长以及保护PC12细胞都与Trx和CDK5表达相关。这些结果为KCl作为治疗神经退行性疾病的新型药物提供了理论依据。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-12
插图和附表清单  12-14
缩略语索引  14-16
第一章 绪论  16-34
  1.1 神经退行性疾病  16-19
    1.1.1 神经退行性疾病简介  16
    1.1.2 帕金森疾病简介  16-17
    1.1.3 MPP~+与帕金森模型  17-19
  1.2 硫氧还蛋白  19-23
    1.2.1 硫氧还蛋白简介  19-20
    1.2.2 硫氧还蛋白的生理功能  20-23
    1.2.3 硫氧还蛋白保护神经元的作用  23
  1.3 CDK5与神经系统  23-25
    1.3.1 CDK5  23-24
    1.3.2 CDK5与帕金森疾病的相关性  24-25
  1.4 去极化以及KCl简介  25-31
    1.4.1 去极化简介  25-29
    1.4.2 KCl的作用  29-31
  1.5 蛋白免疫印迹Western Blot和MTT实验技术原理  31-32
    1.5.1 蛋白免疫印迹Western Blot原理  31
    1.5.2 MTT实验技术原理  31-32
  1.6 本论文研究的目的和意义以及研究策略  32-34
    1.6.1 本论文研究的目的和意义  32-34
第二章 KCl诱导硫氧还蛋白表达的信号通路研究  34-55
  2.1 引言  34-36
  2.2 实验技术路线  36-38
  2.3 材料  38-41
    2.3.1 实验细胞  38
    2.3.2 主要试剂  38-39
    2.3.3 主要试剂的配制  39-40
    2.3.4 仪器设备  40-41
  2.4 方法  41-47
    2.4.1 MTT实验组  41
    2.4.2 蛋白免疫印迹实验组  41-42
    2.4.3 提取细胞中的总蛋白  42-43
    2.4.4 样品的蛋白质定量(BCA法)  43
    2.4.5 蛋白免疫印迹法实验步骤  43-45
    2.4.6 KCl刺激低分化PC12细胞  45
    2.4.7 启动子实验组  45-47
  2.5 实验结果  47-52
    2.5.1 KCl促进PC12细胞增殖  47
    2.5.2 KCl诱导硫氧还蛋白表达的剂量依赖性和时间依赖性  47-48
    2.5.3 KCl通过增加启动子区活性诱导硫氧还蛋白的表达  48-49
    2.5.4 KCl促进细胞分化  49
    2.5.5 MK-801阻断KCl对硫氧还蛋白的诱导  49-50
    2.5.6 KN-62阻断了KCl对硫氧还蛋白表达诱导  50-51
    2.5.7 PD98059阻断KCl对硫氧还蛋白的诱导  51-52
  2.6 分析和讨论  52-55
第三章 KCl诱导CDK5表达的信号通路研究  55-65
  3.1 引言  55-56
  3.2 实验技术路线  56-57
  3.3 材料  57-58
    3.3.1 实验细胞  57
    3.3.2 主要试剂  57-58
    3.3.3 主要溶液及配方(详见2.3.3)  58
    3.3.4 仪器设备(详见2.3.4)  58
  3.5 方法  58-59
    3.5.1 蛋白免疫印迹实验  58-59
    3.5.2 提取细胞中的总蛋白(详见2.4.1.3)  59
    3.5.3 样品的蛋白质定量(BCA法)(详见2.4.1.4)  59
    3.5.4 蛋白免疫印迹法实验步骤(详见2.4.1.5)  59
  3.6 实验结果  59-62
    3.6.1 KCl诱导CDK5表达  59-60
    3.6.2 MK-801阻断KCl对CDK5的诱导  60-61
    3.6.3 KN-62阻断了KCl对CDK5的诱导  61
    3.6.4 PD98059阻断KCl对硫氧还蛋白的诱导  61-62
  3.7 分析和讨论  62-65
第四章 KCl诱导硫氧还蛋白和CDK5表达保护PC12细胞免受MPP+所致损伤的研究  65-75
  4.1 前言  65-67
  4.2 实验技术路线  67-68
  4.3 材料  68-69
    4.3.1 实验细胞  68
    4.3.2 主要试剂  68-69
    4.3.3 主要溶液及配方(详见2.3.3)  69
    4.3.4 仪器设备(详见2.3.4)  69
  4.4 方法  69-70
    4.4.1 MTT实验法  69-70
    4.4.2 细胞排板与药物刺激  70
    4.4.3 提取细胞中的总蛋白(详见2.4.1.3)  70
    4.4.4 样品的蛋白质定量(BCA法)(详见2.4.1.4)  70
    4.4.5 蛋白免疫印迹法实验步骤(详见2.4.1.5)  70
  4.5 实验结果  70-72
    4.5.1 KCl保护PC12细胞免受MPP~+所致细胞毒性  70-71
    4.5.2 KCl回复MPP~+所致PC12细胞中硫氧还蛋白和CDK5表达  71-72
  4.6 分析和讨论  72-75
第五章 KCl诱导硫氧还蛋白和CDK5表达的相关性研究  75-82
  5.1 引言  75-76
  5.2 实验技术路线  76-77
  5.3 材料  77-78
    5.3.1 实验细胞  77
    5.3.2 主要试剂  77-78
    5.3.3 主要溶液及配方(详见2.3.3)  78
  5.4 方法  78-79
    5.4.1 细胞排板与药物刺激  78-79
    5.4.2 提取细胞中的总蛋白(详见2.4.1.3)  79
    5.4.3 样品的蛋白质定量(BCA法)(详见2.4.1.4)  79
    5.4.4 蛋白免疫印迹法实验步骤(详见2.4.1.5)  79
  5.5 实验结果  79-81
    5.5.1 KCl短时刺激对Trx和CDK5表达的影响  79-80
    5.5.2 Trx高表达PC12细胞中CDK5表达情况  80-81
  5.6 分析和讨论  81-82
第六章 结论  82-84
  6.1 证明了KCl诱导PC12细胞硫氧还蛋白表达的剂量和时间相关性  82
  6.2 证明了KCl诱导PC12细胞硫氧还蛋白表达的信号传导途径  82
  6.3 证明了KCl诱导PC12细胞CDK5表达的信号传导途径  82
  6.4 证明了KCl保护PC12细胞免受MPP~+所致损伤与Trx以及CDK #5相关  82
  6.5 初步证明了KCl诱导PC12细胞Trx和CDK5中二者相关性  82-84
致谢  84-85
参考文献  85-91
附录A  91

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑部疾病 > 震颤麻痹综合征
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