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氯化钾诱导硫氧还蛋白和CDK5表达的分子机制
作 者: 李彦辉
导 师: 白洁
学 校: 昆明理工大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: KCl 硫氧还蛋白 细胞周期素依赖性蛋白激酶-5 帕金森病
分类号: R742.5
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要
帕金森氏症(Parkinson’s Disease, PD)是常见的神经退行性疾病,主要临床表现有震颤、僵直、运动减少。病理改变为黑质区的多巴胺神经元进行性慢性坏死。因此保护神经元细胞是治疗该疾病的关键。氯化钾(potassium chloride, KCl)可以使细胞膜去极化,改变细胞膜离子通道通透性,调节质膜和钙库膜上的Ca2+通道,引起细胞内游离Ca2+浓度升高。此外,KCl还具有兴奋细胞,促进神经元存活以及保护神经细胞的作用。硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)是一个分子量为12KDa的多功能蛋白,普遍存在于原核生物和真核生物中。它与NAPDH和硫氧还蛋白还原酶组成细胞内的硫氧还蛋白系统,其具有保守氧化还原活性位点的序列为:-Cys-Gly-Pro-Cys-。它除了具有抗氧化作用外,还有抑制细胞凋亡、调节转录因子活性等作用。很多研究证明Trx与人类疾病密切相关,其中Trx对神经细胞具有保护作用,在神经退行性疾病的发生发展过程发挥重要作用。细胞周期素依赖性蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase 5, CDK5)是脯氨酸依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶。其激动剂P35/P39仅存在于神经系统,故特异性的在神经系统中发挥作用,表现为CDK5对神经细胞具有保护作用。到目前为止,有关KCl诱导Trx、CDK5的表达的研究尚未见报道。我们以大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12为研究对象,探索KCl诱导Trx、CDK5表达及相关机理。结果证明,KCl可以诱导Trx和CDK5的表达增加。另外,我们发现NMDA受体(N-methyl-d-aspartate receptors)抑制剂MK-801, CaMKII (Calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ)抑制剂KN-62以及ERK(extracellular signal-regulated kinase)抑制剂PD98059,可以阻断KC1诱导Trx、CDK5的表达。此外,KCl预刺激后,可以保护神经元免受1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion, MPP+)所致损伤,并且可以回复MPP+引起的Trx和CDK5表达的降低。我们的实验发现KC1去极化对神经细胞保护作用与诱导Trx和CDK5相关,KC1促进细胞生长以及保护细胞免受MPP+所致细胞损伤与NMDA受体、CaMKⅡ、ERK途径有关。综上所述,本研究发现了KCl可以诱导Trx和CDK5表达以及证明了KC1诱导Trx和CDK5表达的相关信号转导通路。并且初步阐明了KCl促进PC12细胞生长以及保护PC12细胞都与Trx和CDK5表达相关。这些结果为KCl作为治疗神经退行性疾病的新型药物提供了理论依据。
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全文目录
摘要 4-6 Abstract 6-12 插图和附表清单 12-14 缩略语索引 14-16 第一章 绪论 16-34 1.1 神经退行性疾病 16-19 1.1.1 神经退行性疾病简介 16 1.1.2 帕金森疾病简介 16-17 1.1.3 MPP~+与帕金森模型 17-19 1.2 硫氧还蛋白 19-23 1.2.1 硫氧还蛋白简介 19-20 1.2.2 硫氧还蛋白的生理功能 20-23 1.2.3 硫氧还蛋白保护神经元的作用 23 1.3 CDK5与神经系统 23-25 1.3.1 CDK5 23-24 1.3.2 CDK5与帕金森疾病的相关性 24-25 1.4 去极化以及KCl简介 25-31 1.4.1 去极化简介 25-29 1.4.2 KCl的作用 29-31 1.5 蛋白免疫印迹Western Blot和MTT实验技术原理 31-32 1.5.1 蛋白免疫印迹Western Blot原理 31 1.5.2 MTT实验技术原理 31-32 1.6 本论文研究的目的和意义以及研究策略 32-34 1.6.1 本论文研究的目的和意义 32-34 第二章 KCl诱导硫氧还蛋白表达的信号通路研究 34-55 2.1 引言 34-36 2.2 实验技术路线 36-38 2.3 材料 38-41 2.3.1 实验细胞 38 2.3.2 主要试剂 38-39 2.3.3 主要试剂的配制 39-40 2.3.4 仪器设备 40-41 2.4 方法 41-47 2.4.1 MTT实验组 41 2.4.2 蛋白免疫印迹实验组 41-42 2.4.3 提取细胞中的总蛋白 42-43 2.4.4 样品的蛋白质定量(BCA法) 43 2.4.5 蛋白免疫印迹法实验步骤 43-45 2.4.6 KCl刺激低分化PC12细胞 45 2.4.7 启动子实验组 45-47 2.5 实验结果 47-52 2.5.1 KCl促进PC12细胞增殖 47 2.5.2 KCl诱导硫氧还蛋白表达的剂量依赖性和时间依赖性 47-48 2.5.3 KCl通过增加启动子区活性诱导硫氧还蛋白的表达 48-49 2.5.4 KCl促进细胞分化 49 2.5.5 MK-801阻断KCl对硫氧还蛋白的诱导 49-50 2.5.6 KN-62阻断了KCl对硫氧还蛋白表达诱导 50-51 2.5.7 PD98059阻断KCl对硫氧还蛋白的诱导 51-52 2.6 分析和讨论 52-55 第三章 KCl诱导CDK5表达的信号通路研究 55-65 3.1 引言 55-56 3.2 实验技术路线 56-57 3.3 材料 57-58 3.3.1 实验细胞 57 3.3.2 主要试剂 57-58 3.3.3 主要溶液及配方(详见2.3.3) 58 3.3.4 仪器设备(详见2.3.4) 58 3.5 方法 58-59 3.5.1 蛋白免疫印迹实验 58-59 3.5.2 提取细胞中的总蛋白(详见2.4.1.3) 59 3.5.3 样品的蛋白质定量(BCA法)(详见2.4.1.4) 59 3.5.4 蛋白免疫印迹法实验步骤(详见2.4.1.5) 59 3.6 实验结果 59-62 3.6.1 KCl诱导CDK5表达 59-60 3.6.2 MK-801阻断KCl对CDK5的诱导 60-61 3.6.3 KN-62阻断了KCl对CDK5的诱导 61 3.6.4 PD98059阻断KCl对硫氧还蛋白的诱导 61-62 3.7 分析和讨论 62-65 第四章 KCl诱导硫氧还蛋白和CDK5表达保护PC12细胞免受MPP+所致损伤的研究 65-75 4.1 前言 65-67 4.2 实验技术路线 67-68 4.3 材料 68-69 4.3.1 实验细胞 68 4.3.2 主要试剂 68-69 4.3.3 主要溶液及配方(详见2.3.3) 69 4.3.4 仪器设备(详见2.3.4) 69 4.4 方法 69-70 4.4.1 MTT实验法 69-70 4.4.2 细胞排板与药物刺激 70 4.4.3 提取细胞中的总蛋白(详见2.4.1.3) 70 4.4.4 样品的蛋白质定量(BCA法)(详见2.4.1.4) 70 4.4.5 蛋白免疫印迹法实验步骤(详见2.4.1.5) 70 4.5 实验结果 70-72 4.5.1 KCl保护PC12细胞免受MPP~+所致细胞毒性 70-71 4.5.2 KCl回复MPP~+所致PC12细胞中硫氧还蛋白和CDK5表达 71-72 4.6 分析和讨论 72-75 第五章 KCl诱导硫氧还蛋白和CDK5表达的相关性研究 75-82 5.1 引言 75-76 5.2 实验技术路线 76-77 5.3 材料 77-78 5.3.1 实验细胞 77 5.3.2 主要试剂 77-78 5.3.3 主要溶液及配方(详见2.3.3) 78 5.4 方法 78-79 5.4.1 细胞排板与药物刺激 78-79 5.4.2 提取细胞中的总蛋白(详见2.4.1.3) 79 5.4.3 样品的蛋白质定量(BCA法)(详见2.4.1.4) 79 5.4.4 蛋白免疫印迹法实验步骤(详见2.4.1.5) 79 5.5 实验结果 79-81 5.5.1 KCl短时刺激对Trx和CDK5表达的影响 79-80 5.5.2 Trx高表达PC12细胞中CDK5表达情况 80-81 5.6 分析和讨论 81-82 第六章 结论 82-84 6.1 证明了KCl诱导PC12细胞硫氧还蛋白表达的剂量和时间相关性 82 6.2 证明了KCl诱导PC12细胞硫氧还蛋白表达的信号传导途径 82 6.3 证明了KCl诱导PC12细胞CDK5表达的信号传导途径 82 6.4 证明了KCl保护PC12细胞免受MPP~+所致损伤与Trx以及CDK #5相关 82 6.5 初步证明了KCl诱导PC12细胞Trx和CDK5中二者相关性 82-84 致谢 84-85 参考文献 85-91 附录A 91
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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑部疾病 > 震颤麻痹综合征
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