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沉默食管癌EC9706细胞CD147表达的初步研究

作　者: 魏文启
导　师: 赵国强；赵明耀
学　校: 郑州大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: CD147 siRNA 基质金属蛋白酶-9 食管癌 侵袭转移
分类号: R735.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


背景和目的CD147是于1982年发现的免疫球蛋白超家族的一员。最初人们认为CD147是一种能够诱导基质金属蛋白酶在成纤维细胞中表达的肿瘤表面蛋白,这种蛋白最初被命名为肿瘤细胞介导的胶原酶启动因子（tumor cell collagenasestimulatory factor,TCSF）。随着它的纯系化,TCSF确定为一种与免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily,IgSF）的蛋白质有高度的同源性的跨膜糖蛋白,并且能够诱导基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）的产生。研究表明CD147在多种肿瘤中高表达,并且与肿瘤的侵润转移密切相关。但是它的表达不仅局限于肿瘤细胞。CD147是一种多效分子,CD147对于胎儿的发育和视网膜的功能起着至关重要的作用,并且已经被证实在胸腺T细胞的发育过程中起作用。由于它表达的广泛性和分子的多效性,研究CD147蛋白与蛋白之间的相互作用及其调控对肿瘤干预治疗策略是十分重要的。因此,本实验拟构建针对CD147基因的siRNA表达载体,脂质体包裹转染入人食管癌细胞株EC9706,检测该细胞中CD147基因表达的沉默效果,初步观察分析CD147基因表达沉默对食管癌EC9706细胞侵袭转移能力的影响。实验方法利用promega siRNA靶序列分析设计系统,扫描人CD147 cDNA编码序列（NM001728）,依据siRNA靶序列设计原则,并且经BLAST同源性分析,选择确定3个针对CD147的siRNA靶序列。分别合成3对靶向CD147 siRNA序列的发卡样DNA单链,退火成双链DNA,重组入siRNA表达载体pGeneClip中;利用PstⅠ酶切筛选鉴定重组子pGeneClip-si257、pGeneClip-si943和pGeneClip-si1203;以M13+/M13-为引物对重组子的插入序列进行DNA序列分析。利用脂质体包裹将siRNA表达载体pGeneClip-si257、pGeneClip-si943和pGeneClip-si1203转入人食管癌EC9706细胞中,同时设空载体对照组（转染空载体pGeneClip）和空白对照组（未转染）;荧光定量RT-PCR方法和Western-Blot检测各组细胞CD147mRNA和蛋白表达水平;ELISA方法检测各组细胞的MMP-9水平;流式细胞术和细胞侵袭实验（Matrigel Invasion Assay）检测各组细胞的细胞周期和侵袭转移情况。实验结果1.初步筛选得到14个候选siRNA靶区段,经过同源序列检索和进一步优选,最终确定257-275位（GATCCAGTGGTGGTTTGAA）、943-961位（GGTCAGAGCTACACATTGA）和1203-1221位（GGGCAGCACCAGAATGACA）为靶序列区段。2.siRNA发卡DNA的退火后三个退火产物si257、si943和si1203,电泳可见三条明亮条带,位于近100bp处,与设计一致。3.PstⅠ酶切筛选得到重组子pGeneClip-si257、pGeneClip-si943和pGeneClip-si1203,测序分析其插入序列与设计完全一致。4.实验组（pGeneClip-si257、pGeneClip-si943和pGeneClip-si1203）的EC9706细胞,CD147基因的mRNA表达水平明显降低,与两个对照组（空载体对照组和空白对照组）比较,差异有显著性（P＜0.05）;其中pGeneClip-si1203的沉默抑制作用最强。5.空白对照组和空载体对照组在约为60kD均有明显印迹条带,而3个实验组的印迹条带都明显弱于空白对照组和空载体对照组;其中以实验3组（转染pGeneClip-si1203）的印迹条带最浅。与荧光定量RT-PCR检测结果一致。6.实验1、2、3组、空载体对照组、空白对照组之间G0～G1期、G2～M期、S期比例及细胞增殖率的差异无显著性（P＞0.05）。7.两个对照组（空载体对照组和空白对照组）MMP-9含量差异无显著性（P＞0.05）:与3个实验组比较差异均有显著性（P＞0.05）。说明抑制食管癌EC9706细胞CD147的表达可抑制细胞MMP-9的产生。8.实验1、2、3组细胞与空载体对照组、空白对照组相比穿透人工基底膜的细胞数明显减少,异性有显著差异（P＜0.05）。实验3组（转染pGeneClip-si1203）的抑制穿透人工基底膜作用强于实验2组和实验1组。结论1.CD147基因1203-1221位（GGGCAGCACCAGAATGACA）是有效沉默表达的siRNA靶序列,构建的siRNA表达载体pGeneClip-si1203,转染食管癌EC9706细胞能显著降低CD147 mRNA和蛋白的表达。2.沉默食管癌EC9706细胞CD147基因的表达,可以有效抑制EC9706细胞的MMP-9的分泌和侵袭转移的能力。

全文目录


摘要  3-6
Abstract  6-11
论文部分 沉默食管癌EC9706细胞CD147表达的初步研究  11-44
  引言  11-12
  实验材料  12-17
  实验方法  17-27
  实验结果  27-36
  讨论  36-39
  小结  39-40
  参考文献  40-44
综述部分 CD147的研究进展  44-63
  参考文献  55-63
附录部分  63-65
  中英文专业词汇对照  63-64
  硕士学位期间发表的论文  64-65
  致谢  65

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 食管肿瘤
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