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DNA双链断裂：乙肝病毒潜在的整合位点

作　者: 胡晓文
导　师: 林菊生
学　校: 华中科技大学
专　业: 内科学
关键词: DNA双链断裂肝炎病毒乙型整合
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 32次
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内容摘要

病毒DNA整合入宿主基因被认为是HBV相关性肝癌发生发展过程中关键的因素之一。研究认为HBV可以在细胞染色体的许多部位整合,整合首先会导致细胞基因组的不稳定,然后根据病毒整合部位及整合片段的不同,从而对机体产生不同的效应。检测病毒潜在的整合靶点将有助于从源头上遏制病毒整合。目的检测细胞DNA双链断裂(DSBs)是否为HBV潜在的整合靶点,如果得到证实,作为基因组最严重的损伤之一因为病毒片段的介入不能及时修复或者修复不完善,会极大促进细胞癌变的进展,为乙肝相关性肝癌的分子发病机制提供了新的研究思路。方法以pEGFP-C1质粒为原始模型构建质粒pEGFP/I-SceI,使其含有I-SceI酶所识别的碱基序列,转染入肝癌细胞株HepG2, G418筛选出稳定株HepG2/I-SceI,从而将I-SceI酶识别序列引入细胞基因组。用含有2% DMSO的胎牛血清作用于该细胞株6天以有利于乙肝病毒入胞及复制表达,收集HBV高拷贝(>107拷贝/ml)病人的血清,进一步浓缩血清获得高浓度病毒颗粒持续感染HepG2/I-SceI细胞,同时瞬时转染表达归位内切酶I-SceI的真核表达载体pCMV(3NSL)I-SceI,采用免疫荧光和Western blot法检测DNA双链断裂效应分子γ-H2AX的表达以检测细胞内DSBs发生情况;PCR检测胞内HBVcccDNA, Western blot检测胞内病毒核心蛋白(HBcAg)说明HBV在细胞体内完成复制表达。提取细胞总DNA,体外I-SceI酶切,收获I-SceI识别序列丧失的基因组DNA,然后巢式PCR扩增插入I-SceI断裂点的核苷酸序列,胶回收纯化后送往上海生工基因测序,测序结果与HBV全基因组BLAST对比分析以了解该特异性损伤位点HBV DNA的整合情况。结果质粒pEGFP/I-SceI被成功构建,γ-H2AX主要定位于细胞核,在空白对照组和转染空质粒组中仅微量表达,而pCMV(3NSL)I-SceI组表达水平显著增高(P<0.05),证明细胞株HepG2/I-SceI中引入特异性I-SceI酶切位点。胞内检测到HBVcccDNA及HBcAg,表明病毒在胞内完成复制并且转录表达蛋白,因为嗜肝DNA病毒必须在复制完成后才能整合,证实了病毒发生整合的可能性。在人为引入的DSBs中可以检测到病毒DNA的整合,与部分HBV X序列同源性为92%,主要为X 5’端碱基序列,3’端碱基缺失,同时在整合端还检测出部分未知的碱基序列。结论DSBs有可能是乙肝病毒一个潜在的整合靶点,可进一步研究病毒整合入宿主DSBs位点精确的分子机制,检测整合与DSBs修复之间存在的关联,从而干预病毒整合,预防由整合导致的基因组的不稳定及一系列肝癌相关效应。

全文目录

英文缩略词表  6-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-12
前言  12-14
实验材料  14-16
第一部分细胞内引入特异性 DNA 双链断裂位点  16-32
  1. 实验方法及步骤  16-27
  2 结果  27-28
  3 讨论  28-30
  附图  30-32
第二部分特异性断裂点病毒整合序列的检测  32-42
  1. 实验方法及步骤  32-37
  2 结果  37-38
  3 讨论  38-41
  附图  41-42
参考文献  42-44
综述  44-52
  参考文献  49-52
致谢  52

DNA双链断裂：乙肝病毒潜在的整合位点

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