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CD147、MMP-9和Annexin Ⅱ蛋白在乳腺浸润性导管癌及纤维腺瘤组织中的表达及意义

作　者: 党秋红
导　师: 李道明；王玉萍
学　校: 郑州大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 乳腺纤维腺瘤乳腺浸润性导管癌 CD147、MMP-9、AnnexinⅡ
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景与目的：乳腺癌是来自乳腺导管或终末导管小叶单元上皮的恶性肿瘤。发病率在过去的50年中呈现出了缓慢上升的趋势,已经超过子宫颈癌的发病率跃居女性恶性肿瘤的第一位。近10年来,我国乳腺癌发病率增加了47%。与欧美国家相比较,我国乳腺癌病人的年龄呈现出年轻化趋势。相关的调查显示,我国每年约有4万人死于乳腺癌,已经成为城市女性的“第一杀手”。目前,乳腺癌的发病机制还未完全阐明,研究显示其发病与雌激素的长期作用、家族遗传倾向、环境因素及长时间大剂量接触放射线等因素有关。乳腺癌的发生发展与其他恶性肿瘤相似,也是一个多步骤多阶段的复杂过程。恶性肿瘤的一个重要特性就是侵袭和转移,其过程同样也是一个复杂的、多步骤的过程。目前普遍认为细胞外基质和基底膜的降解是肿瘤侵袭和转移的重要步骤。已有许多研究表明,细胞外基质的降解和基底膜的重塑是癌细胞侵袭转移过程中的一个关键环节,此过程需要借助蛋白降解酶的表达和激活。目前已知的蛋白降解酶类有半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶及基质金属蛋白酶(matrix metal poroteinases, MMPs)。MMPs是一组重要的细胞外基质降解酶,在肿瘤的侵袭转移过程中此酶通过对细胞外基质中不同成分的降解来发挥其重要作用。MMP-9是MMPs家族中的重要成员,它能降解细胞外基质的主要成分,如Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白,研究认为此过程与肿瘤的侵袭转移密切相关。肿瘤的侵袭是一个多因素共同参与、多步骤完成的复杂过程：(1)肿瘤细胞通过细胞膜表面的受体粘附到细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的层粘连蛋白上；(2)蛋白酶水解前体的释放以及活化；(3)蛋白水解酶对ECM(主要是Ⅳ型胶原蛋白)的降解过程；(4)肿瘤细胞穿过基底膜的迁移过程。这其中,在形成ECM的两大重要组成部分(基底膜和间质)中,基底膜构成一道有效的阻滞屏障,这一屏障是以Ⅳ型胶原为主要成分,因而对其降解成为肿瘤的侵袭与转移的一个关键步骤。大量研究证明,肿瘤细胞的侵袭能力是与其诱导产生蛋白酶降解细胞外基质和基底膜的能力密切相关。在此过程中涉及两大类酶系统：一类是纤溶酶原系统；另一类是基质金属蛋白酶(MMPs)系统。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是MMPs中最为重要的一种蛋白酶。组织金属蛋白酶抑制物(tissue inhibitor of matrixmetalloproteinases, TIMPs)是MMPs的天然抑制剂,TIMPs与MMPs的平衡对于维持细胞外基质的稳态具有重要的作用。CD147作为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN),它是一种新兴的粘附分子,是一种免疫球蛋白超家族的糖蛋白,广泛存在于人体的各个组织、器官。能够调节细胞-细胞、细胞-间质之间的粘附作用,同时参与机体的多种生理过程；并且CD147蛋白在多种肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用。最近研究报道108例膀胱癌患者中通过免疫组织化学方法研究了CD147蛋白的表达情况,研究的结果表明CD147蛋白的表达与膀胱癌患者的淋巴结转移、肿瘤临床分期、组织学分级以及预后呈现出显著相关性。另外通过多因素分析统计显示CD147蛋白的过表达可以作为预后的一个独立危险因素,由此CD147蛋白可以作为一个潜在的治疗靶点。有学者在鼠异种移植模型上证明CD147蛋白通过上调经典的wnt/beta-连环蛋白信号路径能够导致肺癌细胞侵袭、增殖以及转移的发生。有学者通过免疫组织化学方法在48例喉癌患者和15例喉炎患者中分别检测CD147蛋白、MMP-9和MMP-2蛋白的表达情况,结果显示了这三种蛋白的表达在喉癌患者中显著增高,三种蛋白的高表达均与肿瘤的临床分期和淋巴结转移相关。有研究报道在儿童非霍奇金氏淋巴瘤中通过免疫组化方法检测了CD147蛋白和MMP-9蛋白的表达情况,研究结果显示两种蛋白的表达均与肿瘤临床分期、肿瘤大小、骨髓转移、免疫表型及预后不良相关。而且这两种蛋白的高表达均与患者的预后不良相关。最近的研究已表明,成纤维细胞平时仅产生极少量的MMPs,但在有肿瘤细胞存在时可刺激成纤维细胞产生大量的MMPs,已证实这种刺激因子就是存在于肿瘤细胞表面的一种粘附分子--细胞外基质金属蛋白酶诱导因子CD147。CD147参与细胞-细胞、细胞-基质间的相互作用,刺激邻近的间质细胞产生基质金属蛋白酶(MMP-9、MMP-2),并降解细胞外基质,为肿瘤转移创造条件。Annexins蛋白是一类钙结合蛋白家族,其作用受钙离子调节,能够参与一系列与钙离子相关的生物学活动,并且能够结合到带负电荷的膜磷脂上。由于钙离子参与了人体广泛的生物学活动,Annexins的生物学作用因此也备受关注。目前的研究发现AnnexinⅡ蛋白在细胞质和细胞核中具有多种功能,主要表现在：(1)在细胞内AnnexinⅡ蛋白在生物膜结构域的建立或稳定、DNA合成及细胞增殖、胞膜运输、形成离子通道等方面起到了重要的作用；(2)在细胞外的AnnexinⅡ蛋白作为受体,同时还参与了细胞间的粘附、纤维蛋白酶的溶解、配体介导的细胞信号转导以及病毒感染等方面的过程；(3)AnnexinⅡ蛋白的异常表达还参与了人类多种疾病的发生过程。并且它的表达异常和肿瘤的发生、发展有着密切的关系。有关CD147、MMP-9和AnnexinⅡ在乳腺浸润性导管癌和乳腺纤维腺瘤组织中的表达研究在国内外的报道均不多见。本研究在人类乳腺浸润性导管癌组织以及乳腺纤维腺瘤中应用免疫组织化学方法检测了CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白这三个指标的表达,以及这三种蛋白间相互关系。旨在进一步明确CD 147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中的作用以及意义,进一步明确三种蛋白间的相互关系；为探讨乳腺浸润性导管癌的发生、发展和浸润转移机制,从而为更加有效地防治乳腺癌提供一定的理论基础。材料和7方-法1.实验材料60例乳腺浸润性导管癌组织及60例乳腺纤维腺瘤组织存档蜡块取自郑州大学第三附属医院病理科,为2008年1月至2010年1月手术切除标本的存档蜡块,患者均为女性,年龄26-70岁,平均年龄为45.9岁。术前均未进行化疗、免疫及放射治疗。所有标本均经组织病理学检查后证实为乳腺浸润性导管癌及乳腺纤维腺瘤。所有手术切除的标本均经4%中性甲醛固定后石蜡包埋,连续切片,进行组织病理学和免疫组织化学检查。按2003年WHO提出的乳腺分级法标准对乳腺浸润性导管癌H.E切片进行评分和分级。评分标准为：(1)、腺腔形成：占肿瘤的大部分(>75%)为1分,中等程度(10-75%)为2分,少和无(<10%)为3分；(2)、核多型性：小而规则一致的细胞为1分,中等大小及异型性为2分,明显异型为3分；(3)、每10个高倍视野下核分裂像计数：0-5个为1分,6-10为2分,>11个为3分。以上3项得分相加,积分3-5分者为组织学分级Ⅰ级,6-7分者为Ⅱ级,8-9分者为Ⅲ级。2.试剂羊抗人CD147多克隆抗体(sc-25531)购自Santa Cruz公司；MMP-9多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；AnnexinⅡ多克隆抗体(sc-9061)、S-P超敏试剂盒(SP-9001)和DAB酶底物显色试剂盒(DABZLI-9032)均购自北京中杉金桥生物技术开发公司。3.方法免疫组织化学(S-P)方法检测60例乳腺纤维腺瘤组织及60例乳腺浸润性导管癌组织中CD 147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白的表达1)步骤：采用链霉菌素-过氧化物酶法(streptavidin-peroxidase, S-P)。PBS代替第一抗体作阴性对照结果阴性,用已知阳性片作为阳性对照结果阳性。2)判定标准：以细胞胞质出现棕黄色颗粒为AnnexinⅡ蛋白和MMP-9阳性细胞；细胞胞膜及细胞质出现棕黄色颗粒为CD147阳性细胞。结果判定：采用双盲法参照Fromowitz提出的染色标准进行评估：CD147阳性表达为在肿瘤细胞胞膜上及胞质内出现棕黄色颗粒；MMP-9阳性表达在肿瘤细胞胞质内出现棕黄色颗粒。着色强度分为：无色(-)为0分、淡黄色(+)为1分、黄色(++)为2分,黄褐色(+++)为3分。阳性细胞数百分率为：≤30%为0分、31%-70%为1分、≥71%为3分。两项得分相加所得的总分进行结果评定：0分为阴性,(1-2)分为弱阳性(+),(3-4)分为中度阳性(++),(5-6)分为强阳性(+++)。4.统计学分析应用SPSS for windows13.0统计学软件,进行χ2检验及Spearman相关性分析,检验水准α=0.05。结果1. CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白在乳腺纤维腺瘤组织中均呈现阴性表达或仅微弱阳性表达。CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中呈现出较强的表达。三种蛋白的表达在乳腺纤维腺瘤组织与浸润性导管癌组织中的表达相比具有明显的统计学意义(P=0.000)。浸润性导管癌中的阳性率明显高于纤维腺瘤组织。2. CD147蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中阳性表达率为91.67%(55/60)。CD147蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中的表达与年龄(χ2=0.024,df=1,P=0.876>0.05)、家族史(χ2=0.000,df=1,P=1.000>0.05)、肿瘤大小(χ2=1.185,df=2,P=0.553>0.05)及临床分期(χ2=2.937,df=1,P=0.086>0.05)均无关,即不同年龄段、有无家族史、肿瘤大小及临床分期不同的CD147蛋白表达阳性率之间的差异无统计学意义。但CD147蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中的表达与肿瘤的组织学分级相关,即不同组织学分级的CD147蛋白表达阳性率之间的差异具有统计学意义(χ2=8.601,P=0.006<0.01),进一步分别做组织学分级Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅰ级与Ⅲ级的CD147蛋白表达阳性率的比较得到统计结果为：组织学分级Ⅰ级与Ⅱ级CD147蛋白的阳性表达率之间的差异无统计学意义(χ2=4.773,P=0.029>0.05/2=0.025)、Ⅰ级与Ⅲ级CD147蛋白的阳性表达率之间的差异具有统计学意义(P=0.018<0.05/2=0.025),且组织学分级越低,CD147蛋白的阳性表达率就越高。另外,有淋巴结转移和无淋巴结转移的患者的CD147蛋白表达阳性率之间的差异有统计学意义(χ2=7.253,df=1,P=0.007<0.01)。3. MMP-9蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中阳性表达率为86.67%(52/60)。MMP-9蛋白在乳腺浸润导管癌组织中与年龄(χ2=0.341,df=1,P=0.559>0.05)、家族史(χ2=0.192,df=1,P=0.661>0.05)、肿瘤大小(χ2=0.574,df=2,P=0.750>0.05)及临床分期(χ2=1.737,df=1P=0.188>0.05)均无关,即不同年龄段、有无家族史、肿瘤大小及不同临床分期的患者的MMP-9蛋白阳性表达率之间的差异无统计学意义。但MMP-9蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中的表达与肿瘤的组织学分级相关,即不同组织学分级的MMP-9蛋白表达阳性率之间的差异具有统计学意义(χ=6.438,P=0.026<0.05),进一步分别做组织学分级Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅰ级与Ⅲ级的MMP-9蛋白表达阳性率的比较得到统计结果为：组织学分级Ⅰ级与Ⅱ级MMP-9蛋白表达阳性率之间的差异无统计学意义(χ2=1.116,df=l,P=0.291>0.05/2=0.025)、Ⅰ级与组织学Ⅲ级之间的差异具有统计学意义(P=0.018<0.05/2=0.025),且组织学分级越低,MMP-9蛋白的阳性表达率越高。另外,有淋巴结转移和无淋巴结转移的患者的MMP-9蛋白表达阳性率的差异具有统计学意义(χ2=8.679,df=1,P=0.003<0.01)。4. AnnexinⅡ蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中阳性表达率为90.00%(54/60)。AnnexinⅡ蛋白在乳腺浸润导管癌组织中的表达与年龄(χ2=0.365,df=-1,P=0.546>0.05)、家族史(χ2=0.000,df=1,P=1.000>0.05)、肿瘤大小(χ2=1.069,df=-2,P=0.586>0.05)及临床分期(χ2=1.350,df=1,P=0.245>0.05)均无关,即不同年龄段、有无家族史、肿瘤大小及临床分期不同的AnnexinⅡ蛋白表达阳性率之间的差异无统计学意义。但AnnexinⅡ蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中的表达与肿瘤的组织学分级相关,即不同组织学分级的AnnexinⅡ蛋白阳性表达率之间的差异具有统计学意义(χ22=7.356,P=0.017<0.05),进一步分别做组织分级Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅰ级与Ⅲ级的AnnexinⅡ蛋白表达阳性率的比较得到统计结果为：组织分级Ⅰ级与Ⅱ级的AnnexinⅡ蛋白表达阳性率之间的差异无统计学意义(χ2=3.308,df=1,P=0.081>0.05/2=0.025)、Ⅰ级与Ⅲ级之间的差异具有统计学意义(P=0.018<0.05/2=0.025),且组织学分级越低,AnnexinⅡ蛋白的阳性表达率越高。另外有淋巴结转移和无淋巴结转移的患者的AnnexinⅡ蛋白表达阳性率不相同,其差异具有统计学意义(χ2=5.192,df=-1,P=0.023<0.05)。5. CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中表达呈现出两两正相关性。应用统计学方法Spearman相关性检验分析显示CD147与MMP-9两种蛋白间具有显著的相关性,r值为0.769,P值为0.000；CD147和AnnexinⅡ两种蛋白间也具有显著的相关性,r值为0.905,P值为0.000；另外MMP-9和AnnexinⅡ两种蛋白间也具有显著的相关性,r值为0.850,P值为0.000。结论1. CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白在乳腺纤维腺瘤组织中无表达或仅见微弱表达；但在乳腺浸润性导管癌组织中呈现出较强的表达,提示其高表达与乳腺浸润性导管癌的发生有关。2. CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白与乳腺浸润性导管癌的组织学分级及腋窝淋巴结转移相关,提示其表达促进了乳腺浸润性导管癌的进展和淋巴结转移3. CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达存在两两正相关性。提示这三种蛋白在乳腺浸润性导管癌的发生发展中起着协同作用。4. CD147、MMP-9和AnnexinⅡ蛋白的表达在乳腺浸润性导管癌织中的阳性表达率显著增高,而且与其组织学分级和淋巴结转移相关,表明了这三种蛋白在乳腺癌的发生、发展及浸润和转移的过程中可能起到了重要的作用。

全文目录

摘要  4-12
Abstract  12-22
英文缩写词索引  22-23
1 前言  23-26
2 材料  26-30
3 方法  30-33
4 结果  33-50
5 讨论  50-58
6 结论  58-59
7 附图  59-62
参考文献  62-65
综述  65-81
  参考文献  77-81
研究生期间撰写论文  81
研究生学习期间研究的临床科研项目  81-82
致谢  82-83
个人简介  83

CD147、MMP-9和Annexin Ⅱ蛋白在乳腺浸润性导管癌及纤维腺瘤组织中的表达及意义

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