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汉防己甲素联合5-氟尿嘧啶壳聚糖微球防治实验性PVR的实验研究
作 者: 许静
导 师: 毕宏生
学 校: 山东中医药大学
专 业: 眼科学
关键词: 汉防己甲素 5-氟尿嘧啶 壳聚糖微球 增殖性玻璃体视网膜病变 视网膜色素上皮细胞
分类号: R774.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
目的:1.研究Tet与5-Fu对兔眼体外RPE细胞增殖的抑制作用,并探讨其抑制兔RPE细胞增殖的作用机制,以期初步评价药物防治PVR的可行性问题。2.观察Tet联合5-Fu壳聚糖微球(Tet-5-FU-CS-MS)对实验性兔眼PVR模型的防治效果,研究药物在眼内的抗炎机制。方法:1.提取培养兔RPE细胞,传至第四代并鉴定后,选取生长良好的第四代RPE细胞进行试验。设Tet分为2、5、10、15μg/mL组及空白对照组(1O%FBS-DMEM,含0.5%oDMSO, DMSO终浓度≤1‰,对细胞无毒性作用)。5-Fu为5、10、15、20μg/mL组及空白对照组(同上)。噻唑蓝比色(MTT)法检测两组药物对RPE细胞增殖的抑制率,从而测定出增殖抑制率较高而药物浓度相对较低的最佳有效浓度;流式细胞仪(FCM)检测最佳有效浓度的两组药物及空白对照组作用72h后对RPE细胞周期的影响;流式细胞仪(FCM)检测最佳有效浓度两组药物及空白对照组分别作用24h、48h、72h、96h后对RPE凋亡率、线粒体跨膜电位(ΔΨm)、细胞质内Ca2+浓度、Bax, Bcl-2蛋白表达的影响。2.健康成年青紫蓝兔48只,随机分为A、B、C三组,每组16只兔32眼,建立兔眼外伤性PVR模型,向玻璃体中后部注入药物,A组注入含有Tet-5-FU-CS-MS的BSS悬浮液0.2ml,B组注入含有5-Fu聚乳酸微球的BSS悬浮液0.2ml,C组注入25mg无药物壳聚糖微球的BSS悬浮液0.2ml,术后每天观察眼底变化,必要时行眼科B超检查直到注药后第28天,药效评价按Ryan分级法,观察各组视网膜脱离的发生率。分别于术后7天、14天、28天等3个时间点抽取各术眼玻璃体液0.2ml,酶联免疫吸附法(ELISA)检测玻璃体液中TNF-α. IL-1β的含量。成果:1.Tet与5-Fu明显抑制兔体外RPE细胞的增殖,呈时间和剂量依赖性,除作用96h后,Tet1O、15μg/ml及5-Fu15,20μg/ml之间无统计学意义外,其余各质量浓度及时间点之间的比较均有统计学意义(p<0.05),分别选取RPE细胞的增殖抑制率较高而药物浓度相对较低的Tet 10μg/ml)组和5-FU (15μg/ml)组进行下面的实验。Tet与5-Fu两组RPE细胞在72h时G0/G1(合成前期)细胞明显增多,与相应空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05); Tet与5-Fu两组各时间点RPE细胞凋亡率与相应对照组相比明显升高,差异均有统计学意义(p<0.05);随时间延长实验组RPE细胞线粒体ΔΨ逐渐降低,与相应对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05);随时间延长细胞质内Ca2+浓度逐渐升高,与相应对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。Tet(10μg/ml)及5-Fu(15μg/ml)实验组与相应空白对照组相比,均出现Bax蛋白表达增加,Bcl2蛋白表达下降,Bcl-2/Bax比值下降,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。2Tet-5-FU-CS-MS组与5-Fu聚乳酸微球组及空白微球组相比,各时间点视网膜脱离的发生率明显降低,其玻璃体液中TNF-α、IL-1B等炎性因子的含量也显著低于其它两组,方差分析p<0.05,差异有统计学意义。结论:1.Tet与5-Fu对体外兔RPE细胞的增生有明显抑制作用,通过阻断RPE细胞增生周期,干扰Bcl-2及Bax蛋白表达而诱导RPE细胞凋亡,两药联用在防治PVR方面具有潜在价值。2Tet-5-FU-CS-MS显著降低实验性兔眼PVR的发生率,有可能在PVR炎症期发挥抗炎作用,抑制眼内炎性因子的释放,从而起到防治PVR发生的协同作用。
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全文目录
提要 3-5 Abstract 5-10 引言 10-11 第一部分 Tet-5-FU-CS-MS的制备工艺及微球性质研究 11-13 1 研究制备Tet-5-FU-CS-MS的目的 11 2 Tet-5-FU-CS-MS的药理作用 11-12 2.1 壳聚糖微球(chitosan microspheres,CS-MS)的药理作用 11-12 2.2 汉防己甲素的药理作用 12 3 Tet-5-FU-CS-MS的制备 12 4 Tet-5-FU-CS-MS的特性 12-13 第二部分 Tet与5-Fu抑制兔RPE增生的体外实验研究 13-30 概述 13 材料和方法 13-18 1 材料 13-15 1.1 试验药物 13 1.2 主要试验仪器 13-14 1.3 主要试验用试剂 14 1.4 试验细胞 14-15 2 试验方法 15-17 2.1 MTT法检测Tet与5-Fu对RPE细胞增生的抑制率 15 2.2 FCM检测Tet与5-Fu对RPE细胞周期的影响 15-16 2.3 FCM检测Tet和5-Fu对RPE细胞凋亡率的影响 16 2.4 FCM检测Tet与5-Fu对RPE细胞线粒体△Ψm的影响 16 2.5 FCM检测Tet与5-Fu对RPE细胞内钙离子浓度的影响 16-17 3 统计方法 17-18 结果 18-23 1 RPE细胞培养及鉴定 18 1.1 倒置显微镜下RPE细胞的形态观察 18 1.2 抗角蛋白抗体免疫组织化学染色 18 2 Tet与5-Fu对RPE细胞增生的影响 18-19 3 Tet与5-Fu对RPE细胞周期的影响 19 4 Tet与5-Fu对RPE细胞凋亡及凋亡率的影响 19-20 5 Tet与5-Fu对RPE细胞线粒体ΔΨm的影响 20-21 6 Tet与5-Fu对RPE细胞质内Ca2+浓度的影响 21-22 7 Tet与5-FU对RPE Bax蛋白、Bcl-2蛋白表达的影响 22-23 图片 23-26 讨论 26-29 1 Tet与5-Fu抑制体外RPE细胞增生的最佳浓度 26 2 Tet与5-Fu抑制RPE细胞增殖的机制 26-29 2.1 Tet与5-Fu对RPE细胞增殖周期的影响 26-27 2.2 Tet与5-Fu对RPE细胞线粒体ΔΨm及Ca~(2+)浓度的影响 27-29 小结 29-30 第三部分 Tet-5-FU-CS-MS防治实验性兔眼PVR的体内试验研究 30-42 概述 30 材料和方法 30-33 1 实验模型的建立与方法 30-32 1.1 实验动物及分组 30 1.2 实验仪器和耗材 30-31 1.3 动物模型的建立 31-32 2 试验方法 32-33 2.1 眼底观察及药效评价标准 32 2.2 玻璃体液中炎性因子TNF-α及IL-1β的检测 32-33 3 统计学方法 33 结果 33-36 1 Tet-5-FU-CS-MS防治实验性PVR的效果观察 33-34 2 Tet-5-FU-CS-MS对PVR进程中炎性因子的影响 34-36 2.1 IL-1β在兔眼PVR模型玻璃体液中的表达水平 34-35 2.2 TNF-α在兔眼外伤性PVR模型玻璃体液中的表达水平 35-36 图片 36-37 讨论 37-41 1 增殖性玻璃体视网膜病变的发病机制及治疗 37-39 1.1 增殖性玻璃体视网膜病变的发病机制 37 1.2 增殖性玻璃体视网膜病变的治疗 37-39 3 Tet-5-FU-CS-MS防治PVR的效果评价 39-40 3.1 Tet-5-FU-CS-MS阻止PVR发生的机制 39 3.2 Tet-5-FU-CS-MS的眼内缓释作用 39-40 4 Tet-5-FU-CS-MS眼内抗炎机制的研究 40-41 4.1 汉防己甲素眼内抗炎作用及对PVR发生发展的影响 40 4.2 炎性因子与PVR发生发展的关系 40 4.3 Tet-5-FU-CS-MS对炎性因子表达的影响 40-41 小结 41-42 结语 42-43 参考文献 43-46 综述 46-55 参考文献 51-55 致谢 55-56 论文著作 56-60 详细摘要 60-64
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中图分类: > 医药、卫生 > 眼科学 > 视网膜及视神经疾病 > 视网膜疾病
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