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牙周病与As的关系日益受到医学界的重视,现有的流行病学、分子生物学、动物模型和体外实验均表明,牙周病和As存在相关性,但牙周病在As发生,发展过程中的作用机制以及作用环节,特别是对人血管内皮细胞NO信号通路的意义尚报道少见。本实验通过体外维持培养Pg 33277及HUVEC细胞株,分析Pg 33277对HUVEC细胞的入侵能力、NO生成、eNOS及iNOS蛋白表达的影响,从而探讨Pg对血管内皮细胞功能损伤的途径,以期为牙周病在As发病机制中的作用提供实验依据。第一部分牙龈卟啉单胞菌及人血管内皮细胞株的体外维持培养目的在体外培养Pg 33277及HUVEC细胞株,并运用一定的实验方法进行分析和鉴定。材料和方法将Pg 33277冻干粉置于胰蛋白大豆肉汤培养液中培养,培养过程在厌氧罐中进行,利用革兰染色法及哥伦比亚血琼脂板检测Pg的纯度,利用SEM和TEM观察Pg的超微结构,利用PCR技术鉴定Pg的菌毛蛋白基因型。取HUVEC细胞株解冻复苏并维持培养,在倒置显微镜下观察HUVEC细胞形态。结果Pg进行革兰染色后,油镜下可见红色杆状菌体,呈革兰(-);在哥伦比亚血平板上培养5天后形成凸起,有光泽,表面光滑的黑色球形菌落;SEM可见杆状或球杆状的细菌外形,TEM观察Pg表面可见外膜及菌毛结构;PCR菌毛蛋白基因型鉴定Pg 33277为Ⅰ型菌毛蛋白基因型。倒置显微镜下可见HUVEC为圆形或多角形,呈典型的“铺路石”样排列。结论实验证实,在体外,我们已经培养出Pg 33277及HUVEC细胞株,并且生长稳定,状态良好,为下一步实验奠定基础。第二部分牙龈卟啉单胞菌入侵人血管内皮细胞的实验研究目的将Pg与HUVEC细胞进行共培养后,分析Pg对人血管内皮细胞的入侵能力。材料和方法用MOI 1:10, 1:100 Pg 33277分别与HUVEC细胞共培养4、8、12、24h后,0.25%胰蛋白酶消化HUVEC,离心,2.5%戊二醛溶液固定,1%锇酸后固定,制作超薄切片,枸橼酸铅和醋酸双氧铀染色后在TEM下观察,未经Pg感染的HUVEC细胞作为阴性对照组。结果在TEM下观察,可以发现Pg能够利用其菌毛黏附于HUVEC细胞表面,并入侵到细胞内,定植在细胞中,Pg的超微结构未见明显病理改变。结论体外实验证实,Pg能够黏附并入侵到血管内皮细胞中,逃避宿主的免疫防御反应,从而有可能进一步影响血管内皮细胞正常功能的发挥。第三部分牙龈卟啉单胞菌对人血管内皮细胞NO生成的影响目的将Pg与HUVEC细胞进行共培养后,分析Pg对血管内皮细胞NO生成的影响。材料和方法用MOI 1:10, 1:100的Pg 33277与HUVEC细胞共培养,分别于4、8、12、24 h时收集细胞上清液,硝酸还原酶法测定细胞上清液中NO2-的浓度,未受Pg干预的HUVEC细胞作为阴性对照组,SPSS13.0软件包对各样本数据进行单因素方差分析。结果在24 h内,Pg MOI 1:10, 1:100能促进HUVEC细胞NO的生成,与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P <0.05)。结论体外实验证实,Pg能够影响人血管内皮细胞功能的正常发挥,导致内皮细胞NO生成异常,Pg能够促进内皮细胞NO的生成,从而有可能进一步导致血管内皮细胞功能失调。第四部分牙龈卟啉单胞菌对人血管内皮细胞eNOS及iNOS蛋白表达的影响目的将Pg与HUVEC细胞进行共培养后,检测Pg对血管内皮细胞eNOS及iNOS蛋白表达的影响。材料和方法用MOI 1:10, 1:100 Pg 33277与HUVEC细胞共培养,分别于4、8、12、24 h后,RIPA细胞裂解液冰上提取HUVEC细胞总蛋白,Lorry法蛋白定量,分别取50μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳,电泳结束后进行电转移,将蛋白转移到PVDF膜上,分别加兔抗人eNOS多克隆抗体(1:1000)、兔抗人iNOS多克隆抗体(1:1000)和鼠抗人β-action单克隆抗体(1:2000) 4℃过夜,TBST冲洗3遍后,加辣根过氧化物酶标记的二抗常温1.5h,ECL发光试剂盒显色,最后发光,显影,曝光,扫描胶片,JS-300凝胶图像分析仪分析目标条带的光密度值,SPSS13.0软件包对各样本光密度相对值进行单因素方差分析,未受Pg干预的HUVEC细胞作为阴性对照组。结果WB检测结果显示:各组HUVEC细胞均可表达eNOS和iNOS,与阴性对照组相比,Pg MOI 1:10, 1:100干预HUVEC细胞后,eNOS的蛋白表达水平降低,iNOS的蛋白表达水平增加,差异均具有统计学意义(P <0.05)。结论体外实验证实,Pg能够影响血管内皮细胞eNOS和iNOS蛋白表达水平,一方面Pg可以抑制人血管内皮细胞eNOS的蛋白表达,另一方面,Pg能够诱导人血管内皮细胞iNOS蛋白表达。综上所述,本研究通过体外将MOI 1:10, 1:100 Pg 33277与HUVEC细胞共培养后,TEM观察Pg对HUVEC细胞的入侵能力,硝酸还原酶法检测Pg对HUVEC细胞生成NO的影响以及WB检测Pg对HUVEC细胞eNOS及iNOS蛋白表达的影响,结果表明,Pg能够黏附于HUVEC细胞表面,并进入到细胞内,定植在细胞的胞质中,Pg可以抑制HUVEC eNOS蛋白表达,诱导iNOS蛋白表达,最终促进HUVEC细胞NO的分泌,从而提示Pg可以导致内皮细胞功能失调,从而可能在As发生,发展中起促进作用。
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