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天目山土壤产抗芽孢杆菌的分离筛选及其系统发育分析

作 者: 方海环
导 师: 吴雪昌
学 校: 浙江大学
专 业: 微生物学
关键词: 芽孢杆菌 分离与筛选 NRPS和PKSⅠ基因 抗菌活性 表面活性物质 系统发育分析 多相分类学研究
分类号: S154.3
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


芽孢杆菌是一类重要的药源性微生物,能产生丰富的具有人类医药应用价值或动植物病害防治功能的次级代谢产物。为了探索天目山国家自然保护区土壤中具有产次级代谢产物潜能的芽孢杆菌多样性,并期望从分离株中发现新种及新抗生素,本研究从天目山采集土壤样品,采用纯培养的方法,分离获得芽孢杆菌。利用特异性引物扩增法,筛选出基因组中具有编码非核糖体肽合成酶(NRPS)基因或Ⅰ型聚酮合酶(PKSI)基因的菌株。对筛选出的菌株进行抗菌活性和代谢产物表面活性物质的检测,并进行基于16S rDNA序列的系统发育分析,以期挑选出具有较大研究价值的菌株进行进一步的研究。通过分离与筛选,从天目山土壤中共得到35株产芽孢细菌,其中14个菌株的基因组中具有NRPS或PKSI基因。这14株菌株中有9株菌对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌或白色念珠菌表现出不同程度的拮抗作用,7个菌株的代谢产物中检测出了表面活性物质。经16S rDNA序列分析,在这14株菌株中,6株属于芽孢杆菌属,6株属于类芽孢杆菌属,2株属于短芽孢杆菌属,其中有4个菌株为潜在新种。对潜在新种菌株B5进行多相分类学研究,最终确定其为芽孢杆菌新种,命名Bacillus tianmuensis.本研究结果表明,天目山自然保护区土壤中拥有较为丰富的具芽孢细菌产抗微生物多样性。运用基于编码非核糖体肽合成酶(NRPS)基因与Ⅰ型聚酮合酶(PKSI)基因的特异性引物扩增法、并结合抗菌活性及系统发育分析的方法集成,是研究筛选产抗菌株,尤其是筛选潜在产抗新菌株,从而发现产抗新种与新活性化合物的针对性强、较快速的有效方法。此外,芽孢杆菌新种Bacillus tianmuensis的发现,不仅进一步丰富了芽孢杆菌种群,也为探索潜在的新的生物活性化合物提供了新资源。

全文目录


致谢  7-8
摘要  8-9
Abstract  9-11
前言  11-13
材料与方法  13-32
  1 培养基和菌株  13-14
    1.1 芽孢杆菌分离和筛选培养基  13
    1.2 生理生化实验用培养基  13-14
    1.3 菌株信息  14
  2 试剂和主要器材  14-17
    2.1 鉴定用染剂及试剂  14-15
    2.2 DNA提取所需试剂  15-16
    2.3 PCR扩增所需试剂  16
    2.4 主要器材  16-17
  3 土样采集与芽孢杆菌的分离  17
  4 基因组中含NRPS或PKSⅠ基因的芽孢杆菌的筛选  17-19
    4.1 细菌基因组DNA的提取  17-18
    4.2 基因组中含NRPS基因的芽孢杆菌的筛选  18
    4.3 基因组中含PKSⅠ基因的芽孢杆菌的筛选  18-19
  5 抗菌活性检测  19
  6 生物表面活性物质的检测  19-20
    6.1 血平板溶血实验  20
    6.2 液滴坍塌实验  20
  7 细菌16S rDNA的扩增及系统发育分析  20-24
    7.1 16S rDNAPCR扩增  20-21
    7.2 PCR产物割胶回收  21
    7.3 目的片断与pMD19-T载体连接  21-22
    7.4 制备感受态细胞  22
    7.5 重组质粒的转化  22-23
    7.6 白色菌落PCR验证  23
    7.7 基于16S rDNA序列的系统发育分析  23-24
  8 芽孢杆菌新种B5的多相分类学研究  24-32
    8.1 形态学特征  24
    8.2 生长因子测定  24-25
    8.3 其他生理生化特征测定  25-27
    8.4 基于16S rDNA序列的系统发育分析  27-29
    8.5 细菌细胞壁氨基酸组分分析  29
    8.6 细菌全细胞脂肪酸组分分析  29-30
    8.7 细菌基因组DNA G+C mol%的测定  30-32
结果  32-46
  1 土样中芽孢杆菌的分离  32
  2 含NRPS或PKSⅠ基因的芽孢杆菌的筛选  32-33
  3 抗菌活性检测  33-34
  4 生物表面活性物质的检测  34-36
  5 细菌16S rDNA的扩增及系统发育分析  36-38
  6 芽孢杆菌菌株B5的多相分类学研究  38-46
    6.1 形态特征和生长特性  38-40
    6.2 生理生化特性  40-41
    6.3 基于16S rDNA序列的系统发育分析  41-43
    6.4 细胞化学组分分析  43-45
    6.5 菌株B5的鉴定结论  45-46
讨论  46-49
  1 筛选新化合物与新种资源的方法创新  46
  2 天目山自然保护区土壤芽孢杆菌的多样性  46-47
  3 新种及潜在新种的研究价值及分类学意义  47-48
  4 生物表面活性物质的检测  48-49
参考文献  49-54
文献综述  54-68
  参考文献  64-68

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