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枯草芽孢杆菌NCD-2解磷相关基因的克隆及抑菌物质的分离鉴定

作　者: 李晶
导　师: 马平
学　校: 河北大学
专　业: 植物学
关键词: 枯草芽孢杆菌 降解卵磷脂 phoR基因 Fengycin
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 94次
引　用: 1次
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内容摘要


NCD-2菌株是从棉花根际分离筛选到的一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),对其作用机理研究发现该菌株不仅能够通过分泌抑菌物质对棉花黄萎菌等植物病原真菌起到抑制作用,同时还具有降解有机磷的能力。通过电击转化将含有转座子mini-Tn10的质粒pHV1249转入NCD-2菌株中,并构建了NCD-2菌株的突变子库。从3000多个突变子中筛选到3株丧失解磷能力的突变子,Southern杂交实验证明突变株中转座子均为单拷贝插入,并且具有相同大小的杂交片断,因此认为这三个突变子可能具有相同的遗传背景。对其中一个突变子M216进行了以下研究。运用巢氏PCR技术对突变株M216中转座子插入位点基因的侧翼序列进行克隆和序列分析,结果表明丧失解磷能力突变株中转座子插入基因与B. subtilis 168菌株中phoR基因的相似率达到98%。将phoR基因克隆到pHY300PLK质粒上构建重组载体电击转化M216进行功能互补验证,互补菌株部分恢复了解磷能力,以上结果表明NCD-2菌株中phoR基因与其降解卵磷脂能力具有相关性。本试验同时对NCD-2菌株产生的抑菌物质进行了分离和鉴定。利用盐酸沉淀、甲醇溶解的方法提取NCD-2菌株的脂肽类抗生素。双层培养基法测定提取物对棉花黄萎病菌、番茄灰霉病菌具有拮抗活性,进一步研究表明,抑菌物质能够影响真菌菌丝生长及孢子萌发。脂肽提取物经HPLC分析,获得3组主要的物质峰,其中组分Ⅱ具有抑菌活性。采用MALDI-TOF MS对组分Ⅱ进行质谱分析,确定组分Ⅱ中含有两组分子量相差14Da(CH2)的代谢同系物,一组物质的分子量依次为1446.801,1460.813,1474.830,1488.852,与脂肽类抗生素C15-C18Fengycin A对应分子量相差2Da,推测为Fengycin A的一种异构体,其脂肪酸碳链上具有一个双键；另一组同系物的分子量依次为1462.798,1476.817,1490.839,1504.855,1518.867,鉴定为脂肽类抗生素C14-C18 Fengycin B。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章 文献综述  10-16
  1 枯草芽孢杆菌及其在生防中的应用  10
  2 枯草芽孢杆菌的生防作用机制  10-12
    2.1 竞争作用  10-11
    2.2 拮抗作用  11
    2.3 诱导植物抗病性  11-12
    2.4 促进植物生长  12
  3 解磷细菌及其在植物生长中的作用  12-13
    3.1 关于解磷细菌的研究状况  12-13
    3.2 解磷细菌对植物生长的作用  13
  4 转座子和转座子标签法  13-14
    4.1 细菌转座子  13
    4.2 转座子mini-Tn10  13-14
    4.3 转座子标签技术  14
  5 枯草芽孢杆菌中的双组分调控系统  14
  6 本研究的目的和意义  14-16
第二章 枯草芽孢杆菌NCD-2解磷相关基因的克隆及其特性研究  16-34
  1 材料和方法  16-26
    1.1 材料  16-20
      1.1.1 菌株和质粒  16
      1.1.2 培养基  16-17
      1.1.3 抗生素及浓度  17
      1.1.4 培养条件  17-18
      1.1.5 主要药品及仪器  18
      1.1.6 PCR引物  18-19
      1.1.7 溶液、缓冲液及试剂  19
      1.1.8 碱裂解提取质粒所需主要试剂  19
      1.1.9 DNA提取试剂  19-20
      1.1.10 Southern杂交所需试剂  20
    1.2 方法  20-26
      1.2.1 碱裂解法小量提取细菌质粒DNA  20
      1.2.2 细菌总DNA的大量提取  20-21
      1.2.3 DNA的纯化步骤  21
      1.2.4 NCD-2菌株突变体库的构建  21-22
      1.2.5 解磷能力的定性和定量测定  22-23
      1.2.6 Southern杂交实验  23-25
      1.2.7 解磷突变株中转座子插入位点侧翼序列的克隆  25-26
      1.2.8 突变体的遗传互补实验  26
      1.2.9 碱性磷酸酶含量的定量测定  26
  2 结果与分析  26-31
    2.1 枯草芽孢杆菌NCD-2突变子库的构建及其解磷突变子的筛选  26-28
    2.2 突变株中mini-Tn10插入位点基因的克隆和分析  28-29
    2.3 功能互补实验  29-31
    2.4 碱性磷酸酶活性测定  31
  3 讨论  31-34
第三章 枯草芽孢杆菌NCD-2抑菌物质的分离鉴定  34-42
  1 材料与方法  34-36
    1.1 材料  34
      1.1.1 供试菌株  34
      1.1.2 培养基  34
      1.1.3 主要仪器和试剂  34
    1.2 方法  34-36
      1.2.1 脂肽类抗生素提取物的制备  34-35
      1.2.2 脂肽提取物的抑菌活性测定  35
      1.2.3 脂肽提取物对真菌菌丝生长及孢子萌发的影响  35
      1.2.4 脂肽提取物的分离、纯化  35
      1.2.5 纯化组分的抑菌活性检测  35-36
      1.2.6 纯化组分的MALDI-TOF-MS质谱分析  36
  2 结果与分析  36-40
    2.1 脂肽类抗生素的制备及活性分析  36-38
      2.1.1 脂肽类抗生素的制备  36
      2.1.2 抑菌活性测定  36
      2.1.3 对真菌菌丝生长及孢子萌发的影响  36-38
    2.2 脂肽提取物各组分的活性分析  38-40
      2.2.1 纯化组分的抑菌活性分析  38-39
      2.2.2 组分Ⅱ的质谱分析  39-40
  3 讨论  40-42
第四章 结论  42-43
参考文献  43-48
致谢  48-49
作者简历  49

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用
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