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精液氧化应激检测及其在辅助生殖技术中的应用

作　者: 赵洪鑫
导　师: 张慧琴；施惠娟；房素萍
学　校: 复旦大学
专　业: 妇产科学
关键词: 精子活性氧氧化应激人类精子活力试验毒性质膜完整性存活率荧光染色酶标仪 Transgreen SYBR-14 抗氧化治疗补肾生精汤卵胞浆内单精子注射
分类号: R714.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

第一部分精液氧化应激水平与男性不育的相关性研究目的:通过化学发光法检测不育男性及志愿者原始精液中活性氧(ROS)水平,以探讨精液氧化应激水平与精液质量的相关性。方法:不育对象来自2005.1-2007.12在上海市计划生育科学研究所附属生殖医院不孕不育门诊进行精液检查的男性,共451例不育男性和50名志愿者纳入本研究;使用计算机辅助精子分析系统检测精子密度,动力学参数等指标;使用Diff-Quik染色法评价精子形态学指标;使用化学发光法检测所有研究对象原始精液中活性氧水平,使用白细胞特异探针FMLP检测白细胞;采用匹配的方法选择30份精液,按照活性氧水平分为低、中、高三组,离心分离精浆后,进行人类精子活力试验(HSMA)以评价三组精浆对精子运动的毒性作用。结果:1.志愿者和不育男性原始精液中ROS水平差异有统计学意义(P＜0.05)。2.451份不育患者精液ROS水平呈偏锋分布,中位数为9.68RLU/s每20×10~6精子。3.以50名志愿者精液ROS水平的95百分位数作为阈值,将不育患者精液分为氧化应激阴性组和阳性组,阳性率为46.6%。4.相关性分析提示:精子主要的动力学参数和部分形态学指标与ROS水平存在相关。5.根据FMLP激惹试验结果,将氧化应激阳性的精液标本分为白细胞主导的和非白细胞主导的氧化应激阳性。其中,白细胞因素约为24.3%。6.HSMA的结果表明氧化应激水平对精子的毒性有剂量-效应关系。结论:1.本研究检测了451份不育男性患者精液的ROS水平,氧化应激阳性率为46.6%,其中精浆白细胞因素约占24.3%。2.原始精液ROS水平与精子的活率和形态学参数显著相关3.体外精子活力试验表明氧化应激对精子有毒性作用。第二部分一种检测精子质膜损伤的新技术目的:建立一种适宜临床用于检测人类精子质膜完整性并评价氧化应激对精子质膜损伤程度的新技术。方法:1.筛选出新的荧光染料Transgreen,配合PI,代替市售昂贵的LIVE/DEADSperm Viability Kit试剂盒检测精子质膜完整性。荧光染料使质膜完整的精子发绿色荧光,质膜不完整的精子发红色荧光。在荧光显微镜下计数绿色精子的百分比,即存活率(viability)。2.用Transgreen/PI复染法与LIVE/DEAD Sperm Viability Kit检测同一批精子标本,分析检测结果的相关性。3.以不同的顺序和间隔时间加入Transgreen和PI检测同一批精子标本,以比较Transgreen和PI与精子核的亲和力大小。4.采用体外培养法观察各种染料对精子运动的毒性作用。5.用Transgreen/PI荧光复染法检测451份不育男性精子的存活率;分析精液中氧化应激水平和精子质膜完整性的关系。6.用荧光酶标仪检测Transgreen与LIVE/DEAD Sperm Viability Kit中的SYBR-14染料与精子共孵育时的荧光强度随时间的变化曲线。7.通过荧光酶标仪检测绿色荧光的强度,加入Transgreen或SYBR-14后所有精子激发绿色荧光,强度测得A;再加入PI,PI将死精子中与染色体结合的绿色染料取代,此时再测绿色荧光强度B,定义一个新的指标——精子存活系数=B/A,即代表活精子(质膜完整的精子)发光强度与所有精子发光强度的比值。8.用荧光酶标仪间隔5min检测同一批精液标本两次,分析时间(观察者内)的可靠性(精确性);用荧光显微镜下计数法做同样的检测。比较两种方法的可靠性(精确性)。9.将同一份精液洗涤浓缩,再稀释为不同的密度组,用荧光酶标仪检测其存活系数。10.用荧光酶标仪和荧光显微镜下计数法检测同一批精液标本,分析检测结果的相关性,探讨存活系数是否能够替代传统指标存活率。结果:1.Transgreen/PI与LIVE/DEAD Sperm Viability Kit复染法检测同一批精子存活率,相关系数R=0.927,P＜0.001。2.精液中Transgreen和PI染料加入顺序对精子存活率的检测结果没有影响(P＞0.05)。3.Transgreen/PI与LIVE/DEAD Sperm Viability Kit一样,在加入后2h内,不影响精子的正常运动功能(P＞0.05)。4.用Transgreen/PI荧光显微镜下计数检测不育男性精子存活率,氧化应激阴性和阳性组精子存活率差异有统计学意义。5.Transgreen穿膜进入精子并与染色体结合即可用荧光酶标仪检测到绿色荧光,荧光强度上升较平缓,约40～50min到达平衡。SYBR-14上升较快,约20min到达平衡。6.同种方法不同时刻两次测量精子质膜完整性,使用荧光酶标仪时,R=0.971,P＜0.001;使用荧光显微镜下计数法时,R=0.869,P＜0.01。7.同一份精液稀释为不同密度组,用荧光酶标仪检测存活系数,组间差异无统计学意义。8.存活系数和存活率的相关系数R=0.897,P＜0.001结论:1.Transgreen/PI与LIVE/DEAD Sperm Viability Kit检测结果有非常好的一致性。因此Transgreen/PI可以作为精子存活率检测的方法使用。2.PI与细胞核的亲和力大于Transgreen,使用者不用考虑先加哪个试剂,甚至可以同时加入Transgreen和PI,即可在荧光显微镜或流式细胞仪中检测精子的存活率。3.Transgreen/PI处理2h后对精子运动无毒性作用,因此不影响染色后在荧光显微镜下同时检测存活率和活力,而且荧光染料只对细胞染色的特征可以排除非细胞成分的干扰,因此精子计数将更准确。4.Transgreen与SYBR-14同DNA完全结合所用时间不同。因此应根据不同的核染料选择恰当的时间测量存活系数。5.氧化应激阴性组精子存活率高于阳性组,这与理论相符,也从侧面反映了新型染料在临床应用的价值,可成为今后评价精子抗氧化治疗效果的良好指标。6.用新指标存活系数代替传统的存活率来评价精子质膜完整性,该指标适合描述用荧光酶标仪间接检测出的质膜完整精子百分比。用荧光酶标仪测量精子存活系数的可靠性很高。而常用的荧光显微镜下计数法主观因素强,样品在载玻片上分布不均匀,测量的精子数量十分有限,因此误差较大。而荧光酶标仪以样品所有精子DNA的荧光强度为基础进行测量,测量的精子数量巨大,对样品信息的利用更多,很好地避免了随机误差。且基本上克服了研究者主观因素的影响,提高了检测效率。7.存活系数是一个比值,没有单位,不受绝对荧光强度的影响。不论精子数量多少,荧光强度多高,只要质膜完整的精子比例恒定,存活系数也是一个定值。因此,使用荧光酶标仪无需事先处理精子,无需调整密度,可以直接加样测量,十分方便。8.经过相关性分析,荧光酶标仪和荧光显微镜下计数法的结果相关性较高,说明新指标存活系数能够很好地反映存活率,用存活系数可以有效地评价精子质膜的完整性。第三部分中药补肾生精汤抗氧化治疗男性严重少、弱精子症的研究目的:观察中药补肾生精汤抗氧化治疗男性严重少、弱精子症患者的临床效果。方法:将100例严重男性少、弱精子症患者随机分为中药组(50例)和对照组(50例),中药组应用补肾生精汤治疗并指导同房3个月,对照组仅指导同房。治疗后仍然未育患者中有83例(中药组38例,对照组45例)接受了卵胞浆内单精子注射(ICSI)助孕;观察用药前、后常规精液指标(密度、活力等)和活性氧水平的变化及临床妊娠情况;比较两组继续接受ICSI治疗的患者MⅡ卵子数、受精率、卵裂率、可用胚胎率、平均移植胚胎数、临床妊娠率。结果:1.中药组用药前后患者精子的密度、活率、A+B级精子比例差异有统计学意义(P＜0.05);精液ROS水平明显下降(P＜0.05)。2.有4例患者在服用中药后自然受孕,均已分娩健康新生儿。其中2例在本研究前已接受过ICSI治疗,受精率低,卵裂率低,胚胎质量差未孕,经过本次中药治疗后自然怀孕。对照组无自然受孕者。3.继续接受ICSI助孕的患者,中药组受精率显著高于对照(P＜0.05);中药组中4例患者研究前已接受过ICSI治疗未孕,此次再行ICSI怀孕,并且有冷冻胚胎。结论:中药补肾生精汤有明显的生精、抗氧化作用。在ICSI治疗男性不育前,可用中药进行预防性抗氧化治疗,以获得自然受孕的机会并提高ICSI的成功率。

全文目录

英文缩略语  6-7
中文摘要  7-13
英文摘要  13-17
前言(文献综述)  17-25
  1.男性生殖系统内ROS的种类  17
  2.精液中ROS的防御系统  17-18
  3.精液中ROS的来源  18
  4.精液中ROS升高的相关因素  18-19
    4.1.吸烟  18
    4.2.环境中的物理因素(辐射、温度)  18-19
    4.3.环境中的化学因素  19
  5.ROS对精子结构和功能的影响  19-20
    5.1.ROS对精子膜脂质过氧化反应的影响  19
    5.2.ROS对精子DNA的影响  19-20
  6.活性氧对蛋白质功能的影响  20
  7.精液氧化应激的检测方法  20-22
    7.1.精浆丙二醛含量的检测  20-21
    7.2.SOD活性的检测  21
    7.3.化学发光法直接检测ROS  21-22
      7.3.1.鲁米诺发光体系  21-22
      7.3.2.吖啶类化学物发光体系  22
  8.精液ROS与辅助生殖技术  22-25
第一部分精液氧化应激与男性不育的相关性研究  25-38
  1.材料和方法  26-29
    1.1.研究对象  26
    1.2.主要试剂  26
    1.3.主要仪器设备  26-27
    1.4.方法  27-29
      1.4.1.精液收集和检测  27
      1.4.2.用化学发光法检测精液ROS水平  27
      1.4.3.白细胞FMLP激惹试验  27
      1.4.4.原始精液与离心、洗涤后的精子悬液ROS水平的比较  27-28
      1.4.5.精液标本的分离和保存  28
      1.4.6.人类精子活力试验  28
      1.4.7.统计分析  28-29
  2.结果  29-35
    2.1.研究对象的一般情况与各项精液检测结果  29-30
    2.2.不育男性精液ROS水平分布  30-31
    2.3.原始精液和离心洗涤后的精子悬液ROS水平的比较  31
    2.4.ROS与精液常规指标的相关性分析  31-32
    2.5.用志愿者精液ROS参数的95百分位数作为正常参考值评价不育男性精液  32
    2.6.用白细胞激惹试验评估精液中白细胞浓度以及白细胞对精液ROS的影响  32-33
    2.7.氧化应激阴性组和氧化应激阳性组精液参数的比较  33
    2.8.人类精子活力试验通过匹配选择的三组精浆ROS水平  33-34
    2.9.精子活力试验结果  34-35
  3.讨论  35-38
第二部分一种检测精子质膜损伤的新技术  38-54
  1.材料与方法  40-43
    1.1.研究对象  40
    1.2.主要试剂  40
    1.3.主要仪器设备  40
    1.4.方法  40-43
      1.4.1.LIVE/DEAD Sperm Viability Kit操作方法  40-41
      1.4.2.Transgreen/PI荧光复染法步骤  41
      1.4.3.Transgreen/PI与SYBR-14/PI复染法检测精子存活率结果的相关性  41
      1.4.4.不同的Transgreen和PI加入顺序对精子存活率检测结果的影响  41
      1.4.5.Transgreen和PI染料对精子活率的影响  41-42
      1.4.6.用Transgreen/PI测临床精子标本的存活率  42
      1.4.7.SYBR-14和Transgreen进入精子并与DNA结合的时间曲线  42
      1.4.8.用荧光酶标仪检测精子存活系数  42
      1.4.9.评价荧光酶标仪和人工计数两种方法时间(观察者内)的可靠性  42
      1.4.10.用荧光酶标仪检测不同密度的精子  42
      1.4.11.评价荧光酶标仪和荧光显微镜下计数两种方法检测结果的相关性  42-43
      1.4.12.统计学方法  43
  2.结果  43-51
    2.1.Transgreen/PI复染法荧光显微镜下示意图  43-44
    2.2.Transgreen/PI与SYBR-14/PI复染法检测精子存活率结果的比较  44
    2.3.精液中Transgreen和PI加入顺序对精子存活率检测结果的影响  44-45
    2.4.Transgreen和PI染料对精子活率的影响  45-46
    2.5.用Transgreen/PI检测不育男性精子在不同氧化应激状态下的存活率  46-47
    2.6.Transgreen,SYBR-14穿膜进入精子过程中荧光强度的变化曲线  47-48
    2.7.荧光酶标仪和荧光显微镜下计数两种方法的可靠性(重复性)的比较  48-49
    2.8.用荧光酶标仪测量同一份精液稀释成不同密度组的存活系数  49-50
    2.9.用荧光酶标仪和荧光显微镜下计数法检测结果的相关性  50-51
  3.讨论  51-53
    3.1.荧光复染法检测精子存活系数和存活率的原理  51
    3.2.Transgreen/PI检测精子的存活率的有效性  51
    3.3.Transgreen/PI方法的易操作性  51-52
    3.4.Transgreen/PI复染法对精子运动的影响  52
    3.5.荧光酶标仪结合荧光染料检测精子质膜完整性的原理:  52
    3.6.使用Transgreen/PI荧光复染法测量临床精液标本  52
    3.7.Transgreen和SYBR-14进入精子的时间曲线比较  52
    3.8.荧光酶标仪测量存活系数和荧光显微镜下计数存活率可靠性的比较  52-53
    3.9.不同密度精子存活系数的测量  53
    3.10.荧光酶标仪测量存活系数和荧光显微镜下计数存活率的相关性分析  53
  4.小结  53-54
第三部分中药补肾生精汤抗氧化治疗男性严重少、弱精子症的研究  54-61
  1.临床资料  54-55
    1.1.入选病例  54-55
    1.2.分组方法及一般资料  55
  2.方法  55-57
    2.1.中药抗氧化治疗少弱精子症  55-56
      2.1.1.干预措施  55
      2.1.2.检测指标与方法  55-56
      2.1.3.随访  56
    2.2.ICSI辅助生殖技术  56-57
      2.2.1.ICSI的方法  56
      2.2.2.胚胎评价指标  56-57
    2.3.统计学方法  57
  3.结果  57-58
    3.1.两组患者精液常规和ROS水平比较  57
    3.2.两组患者妊娠结局  57-58
    3.3.不良反应  58
    3.4.接受ICSI治疗的部分患者卵子受精、胚胎发育和临床妊娠率结果比较  58
  4.讨论  58-61
参考文献  61-68
硕士期间发表的论文  68-69
致谢  69-70

精液氧化应激检测及其在辅助生殖技术中的应用

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