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L-谷氨酸产生菌的选育及其代谢调控的研究
作 者: 康传利
导 师: 张伟国
学 校: 江南大学
专 业: 发酵工程
关键词: L-谷氨酸 菌种选育 高温驯化 优化 代谢流分析
分类号: TQ922.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
本文根据代谢工程的基本原理,对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TWQ080进行逐级诱变处理,最终选育出一株谷氨酸产生菌GW46-4。然后对其摇瓶发酵条件及7L罐发酵条件进行了优化,最后又对出发菌株和突变菌株的代谢流量进行了分析。主要研究内容和结论如下:(1)以本实验室保藏菌株谷氨酸棒杆菌TWQ080为出发菌株,经过紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)逐级诱变处理,以高浓度糖、高浓度味精和琥珀酸为唯一碳源的平板进行定向筛选,最终选育出一株谷氨酸产生菌GW46。然后对该菌株进行了耐高温驯化,驯化过程中不断提高培养温度,经过多次驯化,育得一耐高温菌株GW46-4,在未经优化的条件下产酸92.5g/L,比出发菌株提高了31.2%。(2)对菌株GW46-4的种子培养基及培养条件进行了优化,发现最佳种子培养基配方:葡萄糖25g/L、玉米浆30g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、尿素6g/L、硫酸镁0.4g/L;最佳培养条件:初始pH 7.0,装液量30mL/250mL。然后对其发酵培养基及培养条件进行了优化,发现最佳发酵培养基配方:葡萄糖158.3g/L、玉米浆3.2g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、硫酸镁0.8g/L、硫酸锰20mg/L、硫酸亚铁20mg/L、VB1200μg/L;最佳发酵条件:装液量20mL/500mL,接种量8%,种龄7h。在此条件下发酵产酸达102.6g/L,比未优化前提高了10.9%。(3)对菌株GW46-4补料分批发酵条件进行了初步研究,结果发现:最佳初糖浓度100g/L,最佳残糖维持浓度10-20g/L。对菌株GW46-4进行了7L罐发酵条件研究,考察了不同溶氧控制策略和温度控制策略对发酵的影响。结果表明,当溶氧控制在30-40%时效果较好;当温度0-8h控制在32℃,8-16h控制在34℃,16-30h控制在36℃时效果最佳。在优化条件下,经7L发酵罐发酵,产酸达114.2g/L,比未优化前提高了23.5%,转化率达59.4%。(4)建立了L-谷氨酸生物合成的代谢网络模型,对出发菌株和突变菌株的代谢流量分布情况进行了研究,并对其主要节点进行了分析。经丙酮酸节点分析发现,突变菌株较出发菌株CO2固定反应得到加强,而乙醛酸循环相对减弱。经异柠檬酸节点分析发现,突变株合成谷氨酸的流量增加。与出发菌株相比,谷氨酸作为前体物质合成其它氨基酸的流量也相应的减少。
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全文目录
摘要 3-4 Abstract 4-5 目录 5-7 第一章 引言 7-15 1.1 前言 7 1.2 谷氨酸简介及L-谷氨酸的理化性质 7-8 1.3 L-谷氨酸的功能及应用 8 1.4 L-谷氨酸生产的发展历史及现状 8-9 1.5 L-谷氨酸生产使用菌株 9-10 1.6 L-谷氨酸的生物合成途径和关键酶 10-12 1.6.1 葡萄糖代谢 11 1.6.2 糖酵解途径(EMP)和磷酸戊糖途径(HMP) 11 1.6.3 回补途径 11 1.6.4 三羧酸(TCA)循环 11-12 1.6.5 生成谷氨酸的主要酶反应 12 1.7 L-谷氨酸产生菌的选育进展 12-13 1.8 本课题研究的意义及主要内容 13-15 第二章 实验材料与方法 15-19 2.1 实验材料 15-16 2.1.1 出发菌株 15 2.1.2 实验试剂 15 2.1.3 实验仪器 15 2.1.4 培养基 15-16 2.2 实验方法 16-19 2.2.1 培养方法 16 2.2.2 诱变方法 16-17 2.2.3 耐高温驯化方法 17 2.2.4 平板筛选方法 17 2.2.5 摇瓶初筛方法 17 2.2.6 摇瓶复筛方法 17-18 2.2.7 分析方法 18-19 第三章 结果与讨论 19-49 3.1 L-谷氨酸产生菌的选育 19-25 3.1.1 出发菌株遗传标记的鉴定 19 3.1.2 菌体生长曲线测定 19 3.1.3 诱变剂量和时间的确定 19-21 3.1.4 L-谷氨酸产生菌的选育谱系 21 3.1.5 L-谷氨酸产生菌的选育结果 21-25 3.2 L-谷氨酸发酵条件的调控 25-35 3.2.1 种子培养基及其培养条件的优化 25-27 3.2.2 发酵培养基的优化 27-33 3.2.3 发酵条件的优化 33-35 3.3 L-谷氨酸补料分批发酵的研究 35-37 3.3.1 最适初糖浓度的确定 35-36 3.3.2 最适残糖维持浓度的确定 36-37 3.4 L-谷氨酸7L罐发酵条件的研究 37-38 3.4.1 不同溶氧控制策略对产酸的影响 37-38 3.4.2 不同控温方式对产酸的影响 38 3.5 L-谷氨酸生物合成的代谢流量分析 38-45 3.5.1 L-谷氨酸生物合成的代谢网络 39-41 3.5.2 各胞外代谢产物浓度的测定 41-43 3.5.3 出发菌株TWQ080及突变菌株GW46-4代谢流量分配的计算 43 3.5.4 出发菌株TWQ080与其突变株GW46-4代谢流量分布情况比较 43-45 3.6 结论 45-46 3.7 课题展望 46-49 致谢 49-51 参考文献 51-55 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 55
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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制氨基酸 > 谷氨酸
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