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鳗弧菌基因组Fosmid库的构建及毒力相关因子的筛查

作　者: 叶旭红
导　师: 茅云翔；莫照兰
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物
关键词: 鳗弧菌 Fosmid文库文库测序毒力因子 aroA基因克隆 prtV基因功能鉴定
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种对鱼类危害严重的细菌病原,常给水产养殖业造成巨大的经济损失。由于鳗弧菌的基因组信息尚未阐明,限制了许多研究工作的深入开展。本研究构建了鳗弧菌的Fosmid基因组文库,对文库的部分克隆进行了末端测序;根据序列的生物信息学分析,对可能的毒力相关因子进行了预测;在此基础上从文库克隆和鉴定了一个营养必须基因(aroA)和一个蛋白酶基因(prtV)。主要结果如下:1、鳗弧菌Fosmid基因组文库的构建和鉴定本研究构建了鳗弧菌的Fosmid基因组文库,该文库包含960个克隆,插入片断平均长度为40 kb。该文库覆盖鳗弧菌基因组(估计为5Mb)的9.1倍,得到任意单拷贝DNA序列的概率大于99%。同时我们建立了该文库的超级池和二级池,用于目的基因的的PCR筛选,所筛选的11个基因的阳性克隆数在2 -11之间,表明该文库可以很好地用于目的基因的筛选。2、鳗弧菌Fosmid基因组文库末端序列分析从鳗弧菌Fosmid基因组文库随机挑取600个克隆进行双末端测序,获得927条序列。加上原有随机片断文库的442条序列,共获得序列总长646,472bp,大约占基因组的19.35%。对这些序列进行如下分析:首先,BLASTN比对结果表明在1369条序列中,有718条序列与数据库现有的序列有明显的相似性(E< e-5),占测序总数的52.44%。BLASTX比对结果,与nr数据库序列相似的有1106条;与EST数据库相似的有826条。其次,根据文库BLASTX的比对结果及相关文献资料,预测出与毒力相关的基因24个,分别为溶血素基因3个,重复序列毒素基因4个,鞭毛基因9个,菌毛基因2个,蛋白酶基因6个。3、从鳗弧菌Fosmid基因组文库克隆aroA基因从鳗弧菌Fosmid基因组文库筛出含有aroA基因的克隆,经genomic walking PCR得到aroA全基因。该基因全长1281 bp,编码427个氨基酸残基,含有一个11个氨基酸残基的信号肽。分子量为46,177 Dalton。鳗弧菌aroA的蛋白编码序列与其他细菌的aroA同源,序列相似性在78%-82%。4、PrtV基因的克隆及鉴定从鳗弧菌Fosmid基因组文库克隆prtV基因,该基因序列全长2778bp,编码926个氨基酸,分子量约102kDa。构建了PrtV基因插入失活突变株及其互补株。PrtV基因缺失后,生长能力有所下降,细菌的明胶酶活性、N -乙酰-葡萄糖胺酶活性下降,溶血活性下降,毒力与野生型相比下降了两个数量级,因此PrtV基因对鳗弧菌毒力有明显的作用。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章文献综述  12-22
  引言  12
  第一节微生物基因组学研究  12-17
    1 微生物基因组研究方法  12-14
      1.1 模式微生物基因组的研究  12-13
      1.2 最小基因组研究  13
      1.3 比较基因组学研究  13-14
      1.4 生物信息学研究  14
    2 病原微生物功能基因组学的研究  14-17
      2.1 对Koch 氏原则和毒力基因概念的新认识  14-15
      2.2 病原菌功能基因组学的研究  15-17
  第二节鳗弧菌毒力相关基因的研究进展  17-22
    引言  17
    1 外毒素(exotoxin)  17-18
      1.1 溶血素(hemolysin)  17-18
      1.2 重复序列毒素(repeat in toxin，RTX)  18
    2 粘附因子(adherence／clonization factor)  18-19
      2.1 鞭毛(flagellum)  18-19
      2.2 菌毛(pilus)  19
    3 侵袭因子(invasion factor)  19-20
    4 细胞表面成分(cell surface components)  20
    5 铁吸收系统(iron uptake system)  20-22
第二章鳗弧菌Fosmid 基因组文库的构建和特性分析  22-47
  第一节鳗弧菌Fosmid 基因组文库的构建  22-35
    引言  22
    1 材料与方法  22-28
      1.1 菌株  22
      1.2 试剂  22-23
      1.3 仪器  23-28
    2 结果与讨论  28-35
      2.1 高质量基因组DNA 的获得  28-29
      2.2 末端修复及合适片断的回收  29-30
      2.3 包装及转导  30-31
      2.4 克隆的保存  31
      2.5 超级池的构建  31-32
      2.6 文库鉴定  32-35
  第二节鳗弧菌基因组的特征分析  35-47
    引言  35
    1 材料与方法  35
      1.1 材料  35
      1.2 方法  35
    2 结果与分析  35-44
      2.1 测序结果  36
      2.2 生物信息学分析  36-43
      2.3 影响鳗弧菌毒力基因的预测  43-44
    3 讨论  44-47
      3.1 测序结果  44
      3.2 毒力基因的预测  44-47
第三章从鳗弧菌M3 Fosmid 文库筛选aroA 基因  47-55
  引言  47
  1 材料和方法  47-48
    1.1 从鳗弧菌M3 Fosmid 文库筛选aroA 基因的策略  47-48
    1.2 生物信息学分析  48
  2 结果  48-52
    2.1 从鳗弧菌M3 Fosmid 文库中克隆aroA 基因  48-50
    2.2 鳗弧菌M3 aroA 基因核苷酸序列分析  50
    2.3 鳗弧菌aroA 基因氨基酸序列分析  50-52
  3 讨论  52-55
第四章鳗弧菌 PrtV 基因的功能鉴定  55-73
  引言  55
  1 材料和方法  55-62
    1.1 从鳗弧菌M3 Fosmid 文库筛选PrtV 基因  55-56
    1.2 鳗弧菌PrtV 基因插入失活突变株构建策略  56-59
    1.3 鳗弧菌PrtV 基因插入失活突变株互补株的构建  59-61
    1.4 鳗弧菌PrtV 基因插入失活突变株及互补株的毒力及生化鉴定  61-62
  2 结果  62-71
    2.1 从鳗弧菌M3 Fosmid 文库中克隆PrtV 基因  62-65
    2.2 PrtV 基因插入失活突变株的构建和互补株的构建  65-66
    2.3 毒力及生化鉴定  66-71
  3 讨论  71-73
个人简介  73
学术成果  73-74
参考文献  74-81
致谢  81

鳗弧菌基因组Fosmid库的构建及毒力相关因子的筛查

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