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以细小色矛线虫为模型动物的环境雌激素活体筛选

作　者: 康亦珂
导　师: 汝少国
学　校: 中国海洋大学
专　业: 生态学
关键词: 细小色矛线虫环境雌激素活体筛选卵黄原蛋白原位杂交
分类号: X174
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目前,已建立的较成熟环境雌激素快速筛选方法主要包括离体筛选和活体筛选两大类,离体筛选快速、便捷；活体筛选更能反映环境雌激素对生物体的效应及其机制,一般认为结果更可靠。因此活体动物模型筛选方法相比较而言具有更大的实践意义。应用较广的活体筛选模型动物为鼠和鱼类,但其存在实验周期较长,实验费用高等缺点,而选择自由生活海洋线虫作为模式生物便可以解决这一问题。自由生活海洋线虫(Free-living marine nematode)是线虫动物门(Nematode)的一个重要组成部分,其种类繁多且分布广泛,从滨海潮间带的高潮线到深海大洋的最深海沟,以及从寒冷的两极到深海脊上的高温热泉生境都有它们的分布。细小色矛线虫(Chromadorina germanica)具有个体小、生活史短(14d)、雌雄异体、行两性繁殖的特征,经本实验室自主开发培养,已在实验室进行单种连续培养90多代。卵黄原蛋白(Vitellogenin, VTG)是检测环境雌激素的重要生物标志物,其分子水平上的指标——雄性鱼类VTG mRNA是一种灵敏度高、特异性好的生物标志物。以VTG mRNA为生物标志物的环境雌激素筛选方法主要包括实时定量PCR、Northern杂交、原位杂交等。其中,原位杂交(in situ hybridization)是一种使用标记的核酸探针来检测与其互补的靶核酸在细胞或组织中的位置的技术,不但免除了从组织中提取RNA的步骤,还可以准确地反映出VTG mRNA在组织甚至生物整体样本中的位置及状态,实验结果也更为直观。久效磷农药是一种高效的有机磷杀虫剂,其使用残留对水生生物和人类健康具有潜在的威胁。邴欣等研究表明久效磷农药能够诱导雄性金鱼合成和分泌卵黄原蛋白,是一种环境雌激素。因此,本文拟通过使用原位杂交手段,检测在内源性雌激素(E2)和环境雌激素(久效磷农药)的诱导下细小色矛线虫VTG mRNA的表达,初步探讨了选用细小色矛线虫为研究对象、VTG mRNA为分子水平的生物标志物构建环境雌激素活体筛选模型的可行性。主要研究结果如下：设计了扩增细小色矛线虫VTG基因的兼并引物,通过PCR和RT-PCR的方法,获得了长度为525 bp的一段核苷酸序列。通过在NBCI网站上和生物软件DNAman里分析比对,初步认定这段核酸是细小色矛线虫vit-6的部分序列。根据所获得的细小色矛线虫vit-6的部分序列,设计了针对细小色矛线虫VTG mRNA的寡核苷酸探针,并用地高辛标记,应用此探针进行原位杂交实验,证明了探针可与线虫体内VTG mRNA发生特异性结合。在此寡核苷酸探针序列的基础上,合成了荧光素5-FAM直接标记的探针,进行了灵敏度更高的荧光原位杂交实验,不仅进一步验证了探针与VTG mRNA的特异性结合力,还显示出雄虫体内VTG mRNA的合成量随着环境雌激素暴露浓度的加大有微弱的上升趋势。综上,以克隆出的C. germanica VTG基因片段为模板设计并制备寡核苷酸探针,通过原位杂交的技术手段,能有效地检测出环境雌激素对雄性线虫VTG mRNA的诱导。使用自由生活海洋线虫C. germanica作为环境雌激素快速、活体筛选的模型动物是可行的,具有实际应用意义。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
0 前言  11-14
1 环境雌激素快速筛选方法研究进展  14-21
  1.1 动物模型整体水平  14-15
    1.1.1 大鼠子宫增重方法  14
    1.1.2 水生生物形态学变化观察法  14-15
  1.2 组织与器官水平  15
  1.3 细胞水平  15-17
    1.3.1 细胞培养检测法  15-16
    1.3.2 酵母雌激素筛选测试法(yeast estrogen screen,YES)  16-17
  1.4 分子水平  17-18
    1.4.1 免疫检测法(Immunoassays)  17-18
    1.4.2 生物传感器检测法  18
  1.5 研究展望  18-21
    1.5.1 快速筛选技术的优劣势分析  18-19
    1.5.2 快速筛选模式生物的选择  19-20
    1.5.3 快速筛选技术的甄选  20
    1.5.4 快速筛选试剂盒的研制及应用方向  20-21
2 细小色矛线虫卵黄原蛋白基因的克隆  21-38
  2.1 材料与方法  21-28
    2.1.1 实验动物来源与培养  21
    2.1.2 主要试剂  21-22
    2.1.3 主要仪器  22
    2.1.4 样品采集  22
    2.1.5 RNA提取  22-23
    2.1.6 DNA提取  23
    2.1.7 AMV-RT反应体系  23-24
    2.1.8 引物设计  24
    2.1.9 PCR反应  24-25
    2.1.10 PCR扩增条带的凝胶回收  25-26
    2.1.11 扩增片段的克隆  26-28
    2.1.12 扩增核苷酸序列的特异性检测  28
  2.2 结果与分析  28-34
    2.2.1 电泳检测RNA质量  28
    2.2.2 PCR检测反转录cDNA质量  28-30
    2.2.3 电泳检测基因组DNA质量  30
    2.2.4 引物设计  30-31
    2.2.5 C.germanica VTG基因特异性序列的克隆  31-32
    2.2.6 所得C.germanica VTG基因片段的特异性比对  32-34
  2.3 讨论  34-38
    2.3.1 线虫的VTG基因家族  34-36
    2.3.2 基因克隆与序列比较分析  36-38
3 利用原位杂交技术检测细小色矛线虫VTG mRNA的表达  38-48
  3.1 材料与方法  38-41
    3.1.1 实验动物  38
    3.1.2 主要试剂  38-39
    3.1.3 主要器材  39
    3.1.4 久效磷农药和E_2暴露实验  39-40
    3.1.5 原位杂交检测细小色矛线虫VTG mRNA的表达  40-41
  3.2 结果与分析  41-45
    3.2.1 原位杂交寡核苷酸探针的设计  41-42
    3.2.2 原位杂交结果  42-45
  3.3 讨论  45-48
    3.3.1 原位杂交基础上的快速筛选方法的建立  45-46
    3.3.2 提高寡核苷酸探针的杂交效率和准确率的讨论  46
    3.3.3 原位杂交技术和细小色矛线虫在活体筛选中的应用  46-48
4 利用荧光原位杂交技术检测细小色矛线虫VTG mRNA的表达  48-54
  4.1 材料与方法  48-49
    4.1.1 实验动物  48
    4.1.2 主要试剂  48
    4.1.3 主要器材  48
    4.1.4 久效磷农药和E_2暴露实验  48
    4.1.5 FISH检测细小色矛线虫VTG mRNA的表达  48-49
  4.2 结果与分析  49-52
    4.2.1 荧光原位杂交寡核苷酸探针的设计  49
    4.2.2 荧光原位杂交结果  49-52
  4.3 讨论  52-54
    4.3.1 荧光素标记的探针与原位杂交方法的结合  52
    4.3.2 增强FISH中杂交信号的改进方法  52-53
    4.3.3 以细小色矛线虫为模型动物的荧光原位杂交活体筛选技术  53-54
5 结论  54-55
参考文献  55-63
附录  63-69
致谢  69-70
个人简历  70
发表的学术论文  70

以细小色矛线虫为模型动物的环境雌激素活体筛选

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