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星形胶质细胞与神经干细胞共培养对神经干细胞分化影响的实验研究

作　者: 王立芹
导　师: 王振宇
学　校: 中国医科大学
专　业: 人体解剖学及组织胚胎学
关键词: 神经干细胞星形胶质细胞新生大鼠海马共培养分化
分类号: R329.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

前言神经干细胞neural stem cells, NSCs)的特点：能够自我更新和增殖；具有向神经元和神经胶质细胞多向分化的潜能；免疫原性低；可长期培养。神经干细胞的作用：促进神经组织的修复；作为神经系统疾病基因治疗的载体。神经干细胞存在于哺乳动物中枢神经系统的多个部位。大鼠海马是神经干细胞的主要聚集区,利于获取神经干细胞。新生大鼠海马所占脑体积的比例较成鼠大,便于取材。星形胶质细胞能合成和分泌多种神经因子,促进神经干细胞的定向分化,对神经元的正常活动与代谢都有重要作用。大脑皮质是星形胶质细胞与神经元密切接触的主要场所,从大脑皮质获取星形胶质细胞,有利于认识星形胶质细胞的生物学作用。神经干细胞作为治疗神经系统疾病理想的供体细胞,其作用主要是通过神经干细胞分化的神经元实现。神经干细胞的分化是神经干细胞的重要属性之一,受诸多因素影响,但在很大程度上取决于微环境中神经因子的作用。目的探讨星形胶质细胞(Astrocytes)对诱导新生大鼠海马神经干细胞分化为神经元的影响。材料和方法一、材料新生2-3d的正常Wistar大鼠12只。二、方法(一)神经干细胞的培养和鉴定新生2-3d的Wistar大鼠,无菌分离海马组织,制成细胞悬液,在含碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和B27的DMEM／F12(1：1)无血清培养基中进行神经干细胞的原代培养。原代培养细胞大多数细胞球直径达200gm时行传代培养,传3代的细胞球行单克隆培养。克隆球的部分细胞行巢蛋白(Nestin)免疫细胞荧光染色；部分细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12进行诱导分化,5d后分别行神经元特异性烯醇化酶(neurone specific enolase, NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、半乳糖脑苷脂(galactocerebroside, Galc)免疫细胞荧光染色。(二)星形胶质细胞条件培养液的收集新生2-3d的Wista大鼠,无菌分离出大脑皮质,制成细胞悬液,在含DMEM/F12(1：1)、15%胎牛血清的培养液中行星形胶质细胞的原代培养。用差速贴壁和室温震荡法纯化星形胶质细胞。传3代后部分细胞行GFAP免疫细胞荧光染色,标记星形胶质细胞的纯度；另一部分细胞换成NSCs培养液继续培养48h,收集细胞培养液即为星形胶质细胞的条件培养液(ACM)。(三)神经干细胞的诱导分化培养将单克隆培养的NSCs分为三组：对照组(A组)、ACM:NSCs (1:2)培养组(B组)和Astrocytes和NSCs共培养组(C组)。各组细胞分别接种于含不同培养液的六孔培养板的板孔中,进行诱导分化培养。采用免疫细胞荧光染色及免疫蛋白印迹两种检测方法,检测各组NSCs分化为神经元的比例及其NSE蛋白的表达情况。(四)统计学分析应用SPSS13.0统计分析软件,对神经元的比例进行统计学分析,所有数据采用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用t检验,P<0.05有统计学意义。实验结果一、神经干细胞的鉴定结果单细胞克隆培养的细胞Nestin阳性表达,诱导分化的细胞NSE、GFAP和GalC阳性表达。二、星形胶质细胞鉴定结果GFAP免疫细胞荧光染色显示：96.5%细胞GFAP阳性,细胞纯度适合做后续实验。三、各组神经干细胞向神经元分化的结果各组神经干细胞诱导分化3d时,细胞贴壁分化的程度不同：B组、C组明显比A组快；诱导分化7d时,免疫细胞荧光染色统计学结果表明：A组、B组、C组NSE阳性细胞的比例分别为：14.7%±3.5%,35.2%±4.1,40.3%±3.7。B组、C组诱导分化为神经元的比例明显高于A组(P<0.05),C组最高。B组、C组间无显著性差异(P>0.05)。免疫印迹结果显示：B组、C组NSE的表达量较A组明显增加,B组、C组间无明显差异。结论1、星形胶质细胞具有促进体外培养新生大鼠海马神经干细胞向神经元分化的作用。2、星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响与其分泌的活性物质有关。

全文目录

一、摘要  5-11
  中文论著摘要  5-8
  英文论著摘要  8-11
二、英文缩略语  11-12
三、论文  12-24
  前言  12-13
  材料和方法  13-17
  实验结果  17-22
  讨论  22-23
  结论  23-24
四、本研究创新性的自我评价  24-25
五、参考文献  25-27
六、附录  27-37
  综述  27-35
  在学期间科研成绩  35-36
  致谢  36-37
  个人简介  37

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内容摘要

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