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引物设计及其在EGFR基因分型中的应用

作　者: 饶文波
导　师: 陈超
学　校: 西北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 引物设计 多重PCR引物 错配 基因分型 EGFR MassArray 高温连接酶检测反应 缺口-连接酶链反应 药物基因组学 个体化用药
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


药物基因组学是一门研究基因组信息和药物反应之间关系以及基因组信息和疾病之间关系的科学。人类基因组中某些遗传多态性能够预示药物反应,进而通过检测这些遗传多态性位点就能够预测某个人对某种药物是良性反应、不良反应还是没有反应。这样,药物基因组学致力于使用合理的手段根据每个患者所具有的独特基因构造选择最优的药物治疗方式,确保以最小的负作用取得最大的疗效,从而在临床上实现“个性化用药”。例如,人表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)可作为非小细胞肺癌肿瘤(non-small cell lung cancer, NSCLC)治疗的相关靶点。研究表明：大多数对酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物(如吉非替尼)敏感的患者中在肺腺癌细胞中都存在EGFR酪氨酸激酶域的突变,揭示检测EGFR基因突变能够在临床上指导NSCLC患者对于吉非替尼的个体化用药。而中国人的这种能提高药物疗效的突变频率比西方人要更高,因此对中国人群进行EGFR基因分型具有更加重大的意义。当今的基因分型检测方法很多,基本上是基于PCR技术的。众所周知,引物在PCR之中占居核心的地位。即使对于某些非基于PCR技术的基因分型方法(如侵入法Invader assay)也离不开跟引物性质相似的探针。所以,引物设计是基因分型方法成功的关键,深入研究引物设计非常有必要。本文研究了当今广泛应用的各种基因分型方法,详细系统地研究了引物设计的方法理论以及各种引物设计的生物信息学工具,指导大家如何便捷、完善地设计引物。本研究成功地设计出了一套扩增人类EGFR基因的多重PCR引物,其产物可以便捷地为下游EGFR基因分型提供模板。本研究还详细地介绍了完善的MassArray的引物设计方法。MassArray是当今世界领先的一种SNP基因分型技术,在基因组精细定位、连锁关联性研究、常规基因SNP检测等领域有着广泛应用。借助于MassArray先进的引物设计方法,成功地设计并优化了本实验室所开发的基于高温连接酶检测反应技术(ligase detection reaction, LDR)的一步法引物设计和基于缺口-连接酶链反应(Gap-LCR)的两步法引物设计。这两种基因分型新方法的突出特点是不用借助于医院常规仪器之外的特殊昂贵设备就能够直接应用于临床基因诊断。但是,这两种方法的引物都受SNP位点附近序列的限制,导致某些SNP位点的引物中存在不可避免的严重的发夹等二级结构,进而使得该SNP位点无法检测。为了克服这种限制,试图在引物中引入错配从而破坏掉二级结构。实验结果发现错配使用必须谨慎,因为只有在少数方法的体系中才容许存在错配。论文最后详细讨论了引物设计中使用错配的条件以及其方法。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-10
第一章 前言  10-32
  1.1 药物基因组学概述  10-11
  1.2 EGFR基因检测及个体化用药  11-14
  1.3 基因分型技术综述  14-20
  1.4 引物设计概述  20-32
    1.4.1 一般引物设计指导原则  20-23
    1.4.2 引物设计工具概述  23-29
    1.4.3 多重PCR引物设计  29-32
第二章 引物设计具体内容及结果  32-68
  2.1 EGFR多重PCR引物设计  32-53
    2.1.1 利用引物设计软件设计出一个引物库  32-35
    2.1.2 对引物库中的引物经过筛选  35-36
    2.1.3 利用tem-PCR方法设计试验验证所筛选出的引物  36-39
    2.1.4 对选出的引物进行更换  39-43
    2.1.5 对更换后的引物进行再次试验  43-47
    2.1.6 去除更换后引物中的冗余引物  47-50
    2.1.7 获得多重PCR最佳引物以及使用方法  50-53
  2.2 MsArray法引物设计  53-64
    2.2.1 MsArray原理  53-55
    2.2.2 MsArray引物设计方法  55-63
    2.2.3 MsArray引物设计结果  63-64
  2.3 EGFR基因检测一步法、两步法引物设计  64-68
    2.3.1 一步法、两步法简介  64-65
    2.3.2 一步法、两步法引物设计方法  65
    2.3.3 一步法引物设计实验结果  65-67
    2.3.4 两步法引物引物设计实验结果  67-68
第三章 讨论  68-73
  3.1 MsArray对多重PCR引物设计的帮助  68
  3.2 AutoDimer对多重PCR引物设计的帮助  68-69
  3.3 MsArray对一步法、步法引物设计的帮助  69
  3.4 关于引物设计软件的可靠性  69-70
  3.5 关于在引物设计中引入错配  70-73
    3.5.1 容许错配发生的条件  70-71
    3.5.2 引物3’末端的错配  71-72
    3.5.3 引物内部和5’端的错配  72-73
参考文献  73-84
攻读硕士学位期间取得的科研成果  84-85
致谢  85-86

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 基因工程的应用
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