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抗前列腺癌可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3的基础研究

作　者: 任杰
导　师: 高江平；于继云
学　校: 中国人民解放军军医进修学院
专　业: 外科学
关键词: 前列腺肿瘤前列腺干细胞抗原 DNA疫苗免疫治疗蛋白纯化稳定转染
分类号: R737.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景与目的：人前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen, PSCA)高表达于进展期前列腺癌组织及前列腺癌转移灶,与前列腺癌发生、发展密切相关,在前列腺癌诊断和治疗研究中备受重视。本研究选择人PSCA作为免疫治疗的靶点,以塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus, SFV)复制子载体pSCK为基础,构建用于治疗前列腺癌的可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3,同时为评价疫苗的免疫功能,在大肠杆菌BL21系统中表达和纯化了人PSCA的融合蛋白,构建了可以高效表达人PSCA的小鼠B16细胞系。本研究为pSCK-PSCA3疫苗的免疫功能评价奠定了坚实的实验基础,也为前列腺癌的免疫治疗提供了一种全新策略。方法：(1)利用DNA重组技术将PSCA片段克隆入含有GST标签的原核表达载体pET42a,双酶切鉴定后得到正确的重组质粒pET42a-PSCA,转化大肠杆菌BL21后,IPTG诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B柱对诱导蛋白进行纯化,纯化产物进行SDS-PAGE及Western Blot鉴定；(2)利用PCR扩增出人PSCA全长基因的cDNA编码区序列,插入到真核表达载体pcDNA3.1中,双酶切及测序鉴定后得到正确的重组质粒pcDNA3.1-PSCA。利用脂质体法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,G418加压筛选后得到阳性克隆。通过流式细胞术、免疫荧光及Western Blot检测PSCA在细胞系中的表达情况；(3)将sig-PSCA3-Fc-GPI-GM/B7基因片段自pVAX1-PSCA3-FcGB质粒上切下,插入可复制型载体pSCK中,构建可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3,并应用流式细胞术及免疫组化鉴定其在真核细胞中的表达情况。结果：(1)pET42a-PSCA原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE及Western Blot检测显示GST-PSCA融合蛋白诱导表达成功,分子量大小约为43KD。(2) pcDNA3.1-PSCA真核表达质粒构建正确,建立了稳定转染人PSCA的B16细胞系,其表达率接近100%。(3)成功构建了可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3,流式细胞术及免疫组化检测证明该疫苗可以在真核细胞中有效表达。结论：在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了PSCA融合蛋白,筛选出的B16细胞系可以高效表达PSCA基因,成功构建了可复制型PSCA基因疫苗pSCK-PSCA3,为后续肿瘤疫苗的体内外免疫功能研究奠定了基础。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-15
  1、DNA疫苗的免疫学机制  11
  2、可复制型疫苗载体系统的特性和优势  11-13
  3、选择PSCA作为免疫治疗靶抗原的优势  13-15
第一部分 PSCA融合蛋白的原核表达及纯化  15-26
  材料与方法  15-22
  结果  22-24
  讨论  24-26
第二部分稳定转染人PSCA的B16细胞系的建立  26-39
  材料与方法  26-33
  结果  33-37
  讨论  37-39
第三部分可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3的构建及表达  39-50
  材料与方法  39-44
  结果  44-48
  讨论  48-50
总结  50-52
参考文献  52-55
综述  55-64
附录:英文缩略词表  64-66
攻读学位期间发表文章  66-67
致谢  67

抗前列腺癌可复制型DNA疫苗pSCK-PSCA3的基础研究

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